LncRNA p21通過介導Wnt/β-catenin信號通路在調控胃癌轉移中作用和機制

徐建國 曹洪濤 張子龍 冀保妍 王春秋 李生棟 劉國慶

(青海省人民醫院 1腫瘤外科，青海 西寧 810001；2消化內科)

胃癌在臨床中屬于較為常見的惡性腫瘤疾病，其發病機制與個人生活習慣、遺傳因素及幽門螺桿菌等相關因素有關，但目前已有研究證實東部沿海地區和西北地域病發胃癌發生率明顯高于南方〔1，2〕。世界衛生組織報道2018年全球共計新發胃癌患者為100萬例，在諸多癌癥中胃癌發病率占第5，死亡率占第3，且男性發病率高于女性〔3〕。研究發現我國胃癌發病率占全球的40%以上，且僅2014年新發胃癌41萬例，占諸多癌癥的10.79%。早期確診胃癌治療5～10年生存率高達95%，因此早期確診可有效提高患者生存率，且有效的腫瘤標志物對患者病情的判斷和臨床預后具有重要應用價值〔4〕。胃癌在臨床中涉及多種生物學和分子事件，且潛在生物標志可有助于制定胃癌治療計劃。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在諸多腫瘤疾病中均有參與表達，且有研究證實LncRNA參與了胃癌的發生和發展〔5〕。本文觀察分析LncRNA p21是否可通過介導Wnt/β-catenin信號通路而影響胃癌MGC-803的增殖和侵襲。

1 材料和方法

1.1材料 RPMI1640購自Invitrogen公司；裸鼠購自北京實驗動物有限公司；胎牛血清、多聚甲醛、鏈霉素、β-actin抗體、基底膜、Transwell小室均選自Corning公司；涂層基質、TritonX-100和兔抗β-catenin購自CST公司；CCK-8試劑和RIPA裂解緩沖液購自北京索萊寶。

1.2細胞培養 人胃癌細胞MGC-803放于10%胎牛血清中培養后置于37℃培養箱中；細胞均以單層形式生長，細胞達到90%匯合率后再行傳代；丟棄培養基，并使用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行沖洗2次，使用胰蛋白酶0.25%進行消化；細胞間隙增大時，吸棄胰蛋白酶并加入新培養基，制備單細胞懸液。

1.3轉染細胞 過表達LncRNA p21采用慢病毒轉染方式進行重組質粒和對照質粒，并轉入MGC-803中；采用定量PCR擴增檢測篩選出的LncRNA p21在胃癌細胞中的過表達情況。

1.4Transwell 應用Transwell試驗分析法對Transwell遷移和細胞侵襲進行檢測，使用細胞無血清培養基制備1×106細胞/ml的細胞懸液，同時取100 μl接種于Transwell小室上膜，下膜同時加入600 μl含10%血清培養基，細胞穿模24 h，取出小室并涂擦小室上膜細胞，小室下膜細胞采用結晶紫染色1.0%，并使用顯微鏡拍照，選取5個隨機視野計數。

1.5MGC-803細胞形態學檢測方法 將胃癌細胞置于含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素的DMEM培養液中，37℃，5%Co，飽和濕度條件下培養,胰蛋白醇消化，常規換液傳代收集對數生長期細胞，制成1×106/ml的單細胞懸液，設對照組和實驗紅，對照組加入維拉帕米.兩組分別加入終濃度為5 g/ml的Hoechst33342,37℃水浴90 min,商心齊上清，PBS沖洗，重懸于含2%胎牛血清的培養基中.檢測前10 min加入FI至終濃度1×106μmol/L，去除死細胞，用FACS流式細胞儀分選細炮細胞，接種于細胞培養液中培養2 w，達到再次分析的細胞數口后收集細胞做Hoechst33342染色計算細胞比例。

1.6CCK-8和體外成瘤 細胞增殖使用CCK-8進行檢測；5×103個細胞接種至96孔板，并依據制定實驗處理細胞，當細胞達到處理終點時，將舊培養基去除；每孔再次加入100 μl新培養基，并同時將10 μl CCK-8試劑，置于37℃培養箱中孵育2 h；孵育結束后取96孔板放于多功能酶標儀中再450 mm波長處檢測其OD吸光度值。將含有對照質粒MGC-803細胞和1×107個穩定過表達LncRNA p21的MGC-803細胞注入裸鼠腋下皮下組織中，并定期測量裸鼠移植瘤體積的變化，飼養30 d后取出瘤體組織進行測量重量。

1.7免疫熒光和蛋白質印跡法 使用4%多聚甲醛對實驗處理細胞固定30 min后，采用0.5%的Triton X-100通透1 min，并放于5%驢血清溫室下封閉細胞30 min；使用兔抗β-catenin(1∶500稀釋)抗體孵育過夜，第2天采用PBS沖洗3次后采用抗兔二抗于溫室下孵育1 h，洗凈后采用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對細胞核進行封片，并使用共焦顯微鏡進行拍照。使用RIPA裂解緩沖液提取實驗指定細胞內總蛋白；蛋白定量后提取樣品20 μg蛋白，經高溫變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離；將分離蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，并采用脫脂奶粉5%封閉PVDF膜30 min，再次采用β-catenin(1∶2 000稀釋)抗體孵育至第2天后使用TBST洗膜后進行孵育二抗1 h并再次行TBST沖洗，使用定性半定量分析(IPP)和化學發光顯色成像。

1.8統計學方法 應用Graphpad Prism7.0軟件進行方差分析后行單因素方差分析或非配對t檢驗。

2 結 果

2.1過表達LncRNA p21對胃癌MGC-803細胞形態學的影響 與Control組比較，LncRNA p21-OE組MGC-803細胞星狀形態或紡錘改變為較圓低侵襲狀態。見圖1。

2.2過表達LncRNA p21對胃癌MGC-803細胞侵襲和遷移的影響 與Control組比較，LncRNA p21-OE組MGC-803細胞遷移、侵襲能力明顯降低(P<0.05)。見圖2、表1。

圖1 過表達LncRNA p21改變MGC-803 細胞形態學特征(×400)

圖2 過表達LncRNA p21對MGC-803細胞遷移和 侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

表1 過表達LncRNA p21對MGC-803細胞侵襲和 遷移的影響個,n=3)

2.3過表達LncRNA p21對體內外胃癌細胞抑制的作用 與Control組比較，LncRNA p21-OE組3 d、4 d細胞增殖差異有統計學意義(P<0.05)。與Control組比較，LncRNA p21-OE組10 d、20 d、30 d明顯抑制移植瘤體積(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 過表達LncRNA p21對體內外胃癌細胞抑制的作用

圖3 移植瘤體積

2.4過表達LncRNA p21對Wnt/β-catenin信號通路活性的抑制 免疫熒光染色顯示，與Control組比較，LncRNA p21-OE組顯著抑制β-catenin在MGC-803細胞中蓄積(P<0.05)。Western 印跡表明，與Control組比較，LncRNA p21-OE組β-catenin蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖4、圖5、表3。

圖4 過表達LncRNA p21抑制β-catenin在MGC-803細胞中蓄積(免疫熒光染色，×400)

圖5 過表達LncRNA p21抑制β-catenin蛋白表達

表3 過表達LncRNA p21對Wnt/β-catenin信號通路 活性抑制的情況

2.5Wnt/β-catenin信號通路介導LncRNA p21對MGC-803細胞增殖、侵襲、遷移抑制作用 蛋白質印跡法檢測發現LiC1可有效激活LncRNA p21過表達MGC-803細胞Wnt/β-catenin信號通路，且β-catenin表達量顯著升高(P<0.05)；CCK-8實驗表明LiC1可有效增強LncRNA p21過表達MGC-803細胞的增殖(P<0.05)，且Transwell實驗發現LiC1處理LncRNA p21過表達的MGC-803細胞遷移和侵襲有明顯增強(P<0.05)。見圖6、圖7、表4。

圖6 β-catenin蛋白表達

圖7 Vehicle組和LiCl組侵襲、遷移能力 比較(結晶紫染色，×400)

表4 Vehicle組和LiCl組β-catenin蛋白及細胞增殖、遷移、侵襲能力比較

3 討 論

胃癌在臨床中屬于常見惡性腫瘤，早期確診治愈率較高，但晚期者5年生存率僅為20%〔5〕。雖早期確診后治愈率較高但部分患者因耽誤病情導致胃癌死亡率每年呈顯著性升高，目前臨床中急需新生物標志和治療手段以此提高胃癌治愈率〔6，7〕。有研究發現LncRNA直接參與了腫瘤信號調節。LncRNA p21經臨床實驗證實其在多種腫瘤中均有明顯抗癌能力，且LncRNA p21還可有效激活肝細胞癌癥和抑制肝細胞增殖等，可明顯降低患者對索拉菲尼的耐藥性〔8，9〕。前列腺癌中過表達LncRNA p21可直接誘導p53介導細胞凋亡〔10，11〕。本實驗發現LncRNA p21過表達經體外實驗顯示，此標志物可直接抑制MGC-803細胞的侵襲、遷移和增殖，且LncRNA p21在裸鼠成瘤組織中存在明顯抑制胃癌腫瘤的生長作用。

Wnt蛋白屬于分泌棕櫚酰化肽和糖基化，此蛋白可起到調節細胞形態完整、分裂和遷移，且Wnt/β-catenin信號通路異常激活在癌癥中起到重要調節作用〔12，13〕。研究發現LncRNA p21過表達可抑制Wnt/β-catenin信號活性，但Wnt/β-catenin信號可激動LiC1激活LncRNA p21過表達胃癌MGC-803細胞對Wnt/β-catenin信號活性，并促進LncRNA p21過表達對MGC-803細胞的增殖和遷移抑制。

綜上，Wnt/β-catenin信號傳導直接參與了胃癌進展，但LncRNA p21可起到抑制Wnt/β-catenin信號轉導的發揮，從而抑制MGC-803細胞的侵襲、遷移和增殖。