肝腸鈣黏連蛋白與胃癌臨床預后關系及對癌細胞BGC823生物學行為的影響

樊建平 趙玉軍 錢軍

(衢州市人民醫院胃腸外科，浙江 衢州 324000)

胃癌是一種發病率高、癌轉移率高、致死率高的消化系統惡性腫瘤之一〔1，2〕，屬于器質性疾病，發病機制十分復雜。盡管目前的外科手術和化療手段不斷進步，但胃癌的死亡率仍居高不下，胃癌患者的5年生存率遠低于30%〔3〕。胃癌細胞的惡性轉移成為影響治療成功與否的關鍵因素〔4〕。研究證實〔5〕因胃癌的局部復發或遠處轉移導致死亡的患者逐年上升。因此，探究與胃癌的病程發展相關的分子及作用機制在胃癌的診斷和治療中具有重大價值。肝腸-鈣黏連蛋白(CDH17)是新近發現的鈣黏蛋白(CAD)超家族的新成員，屬于一種鈣離子依賴性的細胞黏附蛋白，在正常生理狀態下僅在肝、腸組織中定位表達〔6〕。研究〔7〕顯示CDH17在胃癌中過表達，并且與腫瘤的惡性轉移與侵襲關系密切。Lee等〔8〕研究表明在早期胃腸系統中，CDH17的異常表達是胃腸腺體腫瘤的標志物。Lin等〔9〕研究證實沉默CDH17的表達后明顯抑制胃癌細胞的淋巴轉移，提高胃癌患者生存率。因此，本研究通過對臨床上胃癌組織樣本及胃癌細胞株BGC823的研究，探討CDH17的表達對胃癌細胞侵襲及遷移的作用機制，以期為臨床上胃癌的靶向治療提供新的實驗數據。

1 材料和方法

1.1胃癌組織標本的選取及臨床資料 選取2012年3月至2014年3月在衢州市人民醫院進行手術切除的80例胃癌患者(男28例，女52例，患者年齡38～72歲，中位年齡51歲)的癌組織及對應的癌旁組織(距離癌組織超過2.5 cm)作為研究對象，同時收集胃癌轉移淋巴組織標本45例，入選患者術前均未接受放化療干預，均是首次手術切除病灶，組織病理學確診為原發性胃癌，并納入相關性研究。本研究經醫院倫理委員會批準，患者或其家屬均對本研究的目的知情，并簽署同意書。以定期門診復查和電話相結合的方式對患者進行5年隨訪，總生存期(OS)為從手術開始至患者死亡或隨訪結束。

1.2實驗材料與方法

1.2.1實驗動物 30只，6～8周齡雄性 SD 裸鼠，SPF級，體重(150±30)g，由衢州市人民醫院基礎實驗動物研究中心從浙江海隆生物科技有限公司采購，動物的使用許可證號：SYXK(浙)2019-0024。

1.2.2細胞、試劑及主要儀器 人胃癌細胞BGC823從美國菌種保藏中心ATCC采購。過表達rAAV9-CDH17及陰性對照rAAV9-CDH17-NC由上海吉瑪科技公司提供。DMEM培養基(美國HyClone公司)；膜聯蛋白(ANX)A4，ANXA7抗體、兔抗大鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，Transwell小室(美國Santa Cruz公司)；Western印跡試劑盒(美國sigma公司)，免疫組化試劑盒、全蛋白抽提試劑盒(上海生工生物科技公司)，Lipofectamine3000轉染試劑(美國Corning公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，上海碧云天生物技術公司)。無菌生物工作臺(北京泰克儀器廠)，恒溫恒壓多功能細胞培養箱(上海力新儀器有限公司)；5810R 型高速離心機(日本島津公司) 。

1.3方法

1.3.1免疫組化法檢測CDH17蛋白的表達 將各樣本常規固定，按免疫組化試劑盒要求進行包埋、切片、修復、浸泡、封閉，染色，復染，脫水，干燥、封片后鏡檢。切片結果經病理科兩位醫師根據染色面積(面積范圍≤10%計為0分，>10%且≤25%計為1分，>25%且≤50%計為2分，>50%且≤75%計為3分，>75%計為4分)及染色強度(細胞無染色計為0分，弱黃色計為1分，黃色染色計為2分，棕黃色計為3分)進行評分，兩者積分之和≥3分則為CDH17蛋白陽性表達，<3分則為CDH17蛋白陰性表達。

1.3.2細胞復蘇、培養以及分組處理 將人胃癌細胞BGC823細胞復蘇，接種于DMEM培養基中，37℃，5%CO2條件下恒溫恒壓多功能細胞培養箱進行培養，當細胞的生長密度超過85%時，消化傳代。進行實驗。細胞分為正常組(僅有BGC823細胞，細胞培養基中只加入Lipofectamine3000試劑)、對照組(BGC823細胞經Lipofectamine3000試劑轉染100 nmol/L 的rAAV9-CDH17-NC)、實驗組(BGC823細胞經Lipofectamine3000試劑轉染100 nmol/L 的rAAV9-CDH17)。

1.3.3Transwell小室實驗檢測各組細胞的遷移和侵襲能力 遷移實驗：在Transwell小室的上室底部鋪一層不含血清的40 μl基質膠，細胞分組處理同上，消化細胞并用1 ml的PBS清洗2遍后，同時用無血清RPMI1640培養液將細胞稀釋至1×105個/ml，加200 μl細胞懸液到Transwell上室，加500 μmol/L 含20%胎牛血清(FBS)的RPMI1640到Transwell下室，嚴格按試劑盒要求進行細胞培養、染色，鏡檢并拍照，采用ImagePro Plus6.0對圖片進行細胞計數。侵襲實驗與遷移實驗相同，但不鋪基質膠。

1.3.4裸鼠皮下成瘤實驗 調整細胞濃度，以1×105個/孔接種于96孔培養板中，分組處理同上，置入在恒溫恒壓多功能細胞培養箱37℃繼續培養，待細胞生長密度達到1×106個/ml時，消化細胞，離心5 min，棄掉上清液，加入500 μl PBS，避光放置于冰上，使用1 ml 注射器分別將胃癌細胞懸液注射進預先麻醉好的裸鼠右前肢皮下。接種第5天后連接活體成像系統(IVIS)。留取大鼠皮下成瘤瘤組織轉移圖像。7 w后頸部放血處死裸鼠，收集皮下成瘤的標本，稱量質量同時留取記錄。

1.3.5Western印跡檢測各組細胞中CDH17、ANXA4、ANXA7的表達水平 調整細胞濃度按1×105個/孔接種至6孔板中，分組處理同上，置入恒溫恒壓多功能細胞培養箱繼續培養3 h，加入細胞裂解液，提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量。每個樣本取50 μg樣品，進行凝膠電泳后，轉膜，室溫封閉1 h ，分別加稀釋好的一抗，4℃過夜孵育。次日，取出恢復至室溫，聚丁二酸-共-對苯二甲酸丁二醇酯(PBST)充分洗膜，加適量稀釋好的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫震蕩1 h，PBST洗膜，加電化學發光(ECL)進行顯色，拍照及灰度掃描，最后以GAPDH作為內參蛋白，用Image J 軟件分析各條帶的灰度值。

1.4統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1免疫組化法檢測CDH17蛋白的表達 CDH17在癌旁組織中以陰性表達為主；CDH17在胃癌組織以陽性表達為主，陽性表達率78.75%，且CDH17的表達主要定位在細胞膜及細胞質中；CDH17在胃癌轉移淋巴組織中以陽性表達為主，陽性表達率高達88.89%。見圖1。

圖1 免疫組化檢測標本中CDH17的表達(SP，×400)

2.2CDH17的表達與胃癌的臨床病理指標的相關性分析 不同性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度患者CDH17表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；不同淋巴結轉移、浸潤深度、TNM分期患者CDH17表達差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征患者CDH17表達比較〔n(%)〕

2.3不同CDH17蛋白表達程度胃癌患者生存分析 CDH17陽性患者(n=63)5年生存率為22.22%，陰性表達患者(n=17)5年生存率為41.35%，兩者差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 不同CDH17蛋白表達程度與胃癌患者生存分析

2.4Transwell小室實驗檢測各組細胞的遷移和侵襲能力 與正常組相比，實驗組細胞遷移個數和通過基質膠的個數明顯增多(P<0.05)；正常組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表2。

2.5CDH17對裸鼠成瘤的影響 與正常組相比，實驗組裸鼠內移植瘤的明顯變大，瘤體重量明顯增加(P<0.05)；與正常組相比，實驗組裸鼠內移植瘤瘤體淋巴轉移的病灶比例明顯增加(P<0.05)；正常組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表3、圖4、圖5。

圖3 Transwell小室實驗檢測各組細胞的遷移和侵襲能力(結晶紫染色，×400)

表2 各組細胞遷移和侵襲的數量(個，

表3 瘤體質量和淋巴轉移比例

圖4 CDH17對裸鼠成瘤瘤體轉移的影響

圖5 CDH17 對裸鼠成瘤的影響

2.6CDH17與ANXA4、ANXA7蛋白的關系及表達水平 與正常組相比，實驗組細胞中CDH17、ANXA4、ANXA7的表達水平明顯上升(P<0.05)；正常組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖6。

表4 各組細胞中CDH17，ANXA4， ANXA7的相對表達量

圖6 各組CDH17、ANXA4、ANXA7蛋白表達

3 討 論

Wang等〔10〕研究證實胃癌細胞的惡性轉移和侵襲是胃癌預后差的關鍵因素。胃癌細胞具有較強的侵襲和遷移能力，促使胃癌早期即發生轉移，或者在轉移過程中胃癌細胞會發生進一步變化，導致化療失敗，誘導胃癌復發或者更深層的轉移〔11〕。

研究表明〔12〕胃癌細胞的轉移與侵襲過程中，黏附分子介導的細胞黏附力降低是至關重要的環節。已證實〔13〕鈣黏蛋白介導的細胞黏附在胃癌細胞的轉移與侵襲中發揮著關鍵作用。CDH17定位于8q22.1染色體上，是由832個氨基酸構成的跨膜蛋白。已有的研究證實〔14〕，CDH17在胃正常組織中基本不表達，在胃腸系統腺體癌中高表達，本研究與之一致。本研究結果推斷CDH17的陽性表達可能與腫瘤細胞的侵襲有關。Jin等〔15〕研究表明CDH17的表達上調能增加胃腺癌的轉移率，降低胃癌患者的生存率，起到關鍵的促癌作用。Bartolomé等〔16〕研究證實下調CDH17能明顯降低結腸癌細胞和肝癌細胞的增殖，起到明顯的抑癌作用。這可能與CDH17在不同腫瘤中所起的作用不同或不同組織中CDH17與不同的特異性結合分子結合產生的效應不同有關。本研究結果表明過表達CDH17后，胃癌細胞BGC823細胞的遷移和侵襲能力明顯降增強；體外裸鼠成瘤實驗結果顯示CDH17的促癌作用。

轉移和侵襲是惡性腫瘤的基本生物學特征，這過程中涉及多種蛋白因子相互協調共同作用完成〔17〕。ANXA4和ANXA7是一類與鈣離子特異性結合的鈣依賴性磷脂蛋白。膜聯蛋白結構上含有可變的N-末端結構域，依靠該結構域的變化，膜聯蛋白能直接參與細胞膜的形成、轉運、信號轉導及細胞增殖、分化和凋亡等生物學細胞活動〔18〕。ANXA4和ANXA7作為細胞表面受體，一方面可與組織型纖維蛋白溶解酶原激活物及纖溶酶原特異性結合生成纖溶酶，促進纖維蛋白的降解；另一方面能夠激活內皮細胞的纖溶酶原促進金屬蛋白和多種膜蛋白的水解，細胞外基質的降解，加速腫瘤的血管新生推動腫瘤細胞的浸潤和轉移〔19〕。有研究證實〔20〕ANXA4和ANXA7在胃癌對淋巴轉移過程中發揮了重要作用。本研究結果表明推斷CDH17可能通過調控ANXA4、ANXA7的表達來影響胃癌細胞的轉移和侵襲。

綜上，CDH17在胃癌中呈高表達，并且能夠促進胃癌細胞823的遷移和侵襲，這可能與CDH17能夠調控ANXA4，ANXA7的表達有關。但是CDH17能否通過調控其他蛋白因子的表達來影響胃癌細胞的轉移和侵襲，還需進一步的研究。