益母草堿對Aβ1～42所致老年癡呆大鼠大腦保護作用及機制

柯莉 方登富 潘飛豹 蔣世杰

(遂寧市中心醫院，四川 遂寧 629000)

阿爾茨海默病(AD)世界范圍內患者已逾1億，且隨著人口老齡化程度加深，AD發病率居高不下〔1，2〕。AD的β淀粉樣蛋白(Aβ)級聯是其研究領域最廣泛的假說，相關研究顯示，AD患者細胞非正常凋亡與大腦神經元丟失密切相關，而Aβ過量積累會促進細胞凋亡〔3〕。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)作為機體新陳代謝重要的參與者，在生化反應過程中能夠保持外界能量平衡。臨床學者認為，激活AMPK有利于修復腦卒中患者受損細胞〔4〕。同時AMPK與內皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化水平呈正相關，這對神經再生和修復具有積極意義〔5〕。益母草堿(LEO)是唇形科植物益母草的主要成分之一，具有抵抗血小板凝聚、舒張血管、促進血液循環等生理功能，在保護急性心肌缺血、腦缺血等方面的優勢已經得到證實〔6〕。但目前尚無關于LEO對Aβ1～42誘導的老年性癡呆大腦保護機制的相關報道。本研究探究LEO對Aβ1～42致癡呆大鼠腦保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠購自成都百裕制藥股份有限公司〔許可證號：SYXK(川)2019-222〕，體重為180～220 g，遂寧市中心醫院動物實驗中心飼養，常規飼養，溫度、濕度適宜，循環光照12 h，構建模型前禁食12 h。常規飼養1 w以適應實驗環境，第2周開始實驗流程。

1.2主要試劑 LEO( 批號為：TZ18938，純度>98%)購自西安通澤生物科技有限公司；尼莫地平注射液(NMDP，上海信宜金朱藥業有限公司，批號為：國藥準字H20057745)；TUNEL試劑盒采購自Sigma公司；二氨基聯苯胺(DAB)化學發光試劑盒采購自天津祥盛通達生物有限公司；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒采購自美國abcam公司；p-AMPK、p-eNOS和核轉錄因子(NF)-κB抗體采購自美國Sigma公司，戊巴比妥鈉購自上海恒遠生物技術有限公司，p-AMPK、p-eNOS和NF-κB抗體(美國abcam公司)購自美國PALL公司，冰凍切片包埋劑采購自美國櫻花公司，Western印跡試劑盒購自北京博凌科為生物公司。

1.3模型構建及分組構建 模型前適應性喂養SD大鼠1 w，使用1% 戊巴比妥鈉麻醉Model組、LEO組、NMDP組，麻醉起效后常規消毒鋪巾，剔除大鼠頭頂毛發并清潔皮膚，頭頂部做縱向2 cm傷口，使用鑷子分離骨膜充分暴露顱骨，海馬CA1區應用腦立體定位儀定位〔7〕，將顱骨打開：以前囟后 3.3 mm、中線1.5 mm、硬腦膜下3.0 mm，采用微量注射器向每側注射2 μl微量孵育好的Aβ1～42溶液，為了規避藥物外滲，注射完成后需留針5 min。切口縫合后消毒。切開Sham組硬腦膜后注射生理鹽水2 μl，其他流程與上述操作一致。模型構建完成3 h后，LEO組腹腔內注射LEO 50 mg/kg，NMDP組腹腔注射NMDP 50 mg/kg，注射劑量為10 ml，1次/d，Sham組、Modle組腹腔給予等量生理鹽水，連續注射14 d。

1.4大鼠學習記憶能力檢測跳臺實驗〔8〕跳臺裝置為10 cm×10 cm×30 cm長方形反射箱，用黑色塑料板分隔成為5間。底面是可通電的不銹鋼網柵，設立橡膠站臺，大鼠不離開不銹鋼網柵則會遭受電擊。進行3 d連續實驗，第1天為適應階段，將大鼠面向墻角置于站臺上，網珊不通電，適應環境5 min。第2天為學習階段，大鼠面向墻角輕輕放置于站臺上，然后通以36 V交流電，持續5 min。若動物跳下站臺則受電擊，其正常反應應該是跳回站臺，記錄每只大鼠跳臺失敗次數；第3天為實驗階段，記錄4組第一次受到電刺激及首次跳下站臺的時間。

1.5大鼠大腦皮層血流變化監測 跳臺試驗完成后，使用激光散斑成像檢測4組大腦皮層血流變化，使用0.3%戊巴比妥鈉成功麻醉后，獲取5組額定皮層600 s實時圖像，將內源成像孔與Baumer相機連接，觀察大腦皮質血流灌注量變化情況，并使用散斑軟件計算皮層血流差異。

1.6大鼠腦組織神經元形態 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察檢測大鼠腦組織中細胞凋亡情況，取部分腦組織，采用多聚甲醛固定，制備4 μm的切片，進行HE染色，采用光學顯微鏡觀察癡呆大鼠腦組織神經元的形態變化。

1.7大鼠腦組織中的細胞凋亡 采用TUNEL染色評估大鼠腦組織細胞凋亡率，取部分腦組織，常規固定后，用60℃恒溫烤箱烘烤石蠟腦組織切片3 h，二甲苯脫蠟完成后、梯度濃度酒精脫水處理，分別使用不含DNase的蛋白酶K、磷酸鹽緩沖液(PBS)完成消化，沖洗后，放入3% H2O2溶液中黑暗常溫孵育，依次完成PBS沖洗，生物素標記，分別用DAB、蘇木素顯色、染色，持續脫水至切片透明，封固完成后，使用顯微鏡觀察并留存照片。以完整非重疊的5個高倍鏡(×400)視野計算同一切片的細胞凋亡指數。細胞凋亡指數(AI)=凋亡細胞數/總細胞數× 100%，取其均值。

1.8大鼠腦組織中IL-1β、IL-6 和 TNF-α的水平 將細胞裂解液加入部分腦組織中，離心取上層清液，根據ELISA 試劑盒操作說明檢測IL-1β、IL-6 和 TNF-α的水平。檢測完成后，在450 nm處OD值應用采用酶標儀測量。

1.9大鼠腦組織中NF-κB的核移位 取部分腦組織石蠟切片，按照免疫熒光的試劑盒說明書：60℃恒溫箱中烤2 h，待恢復室溫后脫水、脫蠟、抗原修復處理，1%牛血清白蛋白(BSA)、一抗體中、二抗中分別封閉20 min、孵育1.5 h、孵育30 min，操作中選擇PBS洗滌，熒光顯微鏡觀察NF-κB的核移位現象，平均光密度應用圖片分析程序測定。

1.10大鼠腦組織中p-AMPK、p-eNOS和NF-κB的表達采用Western印跡檢測 在裂解液中加入部分腦組織，加入裂解液，冰上放置20～30 min，超聲裂解30 s，12 000 r/min，4℃離心10 min，收集上清，置于-20℃保存。收集組織液中總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說明書測定總蛋白表達水平，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)完成后，展開轉膜、封閉流程，稀釋后的p-AMPK、p-eNOS和NF-κB蛋白一抗添加完成后，在4℃恒溫條件下孵育過夜，加入標記辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗鼠二抗，常溫條件下2 h孵育完成后，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜，增強化學發光(ECL)顯影后黑暗下曝光拍照，內參選擇GAPDH。

1.11統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1各組學習成績和記憶成績 4組學習和記憶成績差異有統計學意義(P<0.05)；Model組學習成績高于sham組，記憶成績低于Sham組，差異具有統計學意義(P<0.05)；LEO組學習成績低于Model組，記憶成績高于Model組，差異具有統計學意義(P<0.05)；LEO組與NMDP組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組學習記憶能力、腦皮層血流灌注量、腦組織細胞凋亡率、IL-1β、IL-6和TNF-α的水平的比較

2.2激光散斑成像檢測大腦皮層血流變化 4組大腦皮層血液灌注量差異明顯(P<0.05)，Model組大腦皮層血流灌注量顯著少于Sham組(P<0.05)，LEO組、NMDP組大腦皮層血流灌注量顯著多于Model組(P<0.05)，LEO組與NMDP組比較無明顯差異(P>0.05)，見表1、圖1。

2.3各組腦海馬區形態學的比較 HE 染色結果顯示，Sham組海馬區神經元細胞核較大且細胞結構完整、規律排列，細胞形態正常；Model組海馬區神經元細胞細胞核染色模糊且結構大小不一，排列不規則，細胞核縮小且出現較多的凋亡的神經元。LEO組可明顯減少神經元丟失，改善神經元異常形態；NMDP組與LEO組海馬區神經元結構相似，見圖2。

2.4TUNEL染色觀察腦組織中細胞凋亡 4組腦組織中細胞凋亡率均具有明顯差異(P<0.05)，Model組細胞凋亡率顯著高于Sham組(P<0.05)，LEO組、NMDP組細胞凋亡率顯著低于Sham組(P<0.05)，LEO組與NMDP組凋亡率比較無明顯差異(P>0.05)，見表1、圖3。

圖1 各組腦皮層血流灌注量

圖2 各組腦海馬區形態學的比較(×200)

圖3 TUNEL染色檢測各組腦組織細胞凋亡(×400)

2.5ELISA 法檢測腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平 4組腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α均具有明顯差異(P<0.05)。Model組IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著高于Sham組(P<0.05)，LEO組、NMDP組IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著低于Model組(P<0.05)；LEO組與NMDP組差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.6免疫熒光檢測腦組織中NF-κB的核移位 4組腦組織細胞內NF-κB核移位熒光強度具有明顯差異(P<0.05)。Model組NF-κB核移位熒光強度強于Sham組，LEO組、NMDP組NF-κB核移位熒光強度弱于Model組，差異均具有統計學意義(P<0.05)；LEO組與NMDP組無明顯差異(P>0.05)，見圖4、表2。

圖4 免疫熒光檢測NF-κB核位移(×400)

2.7Western印跡檢測腦組織中p-AMPK、p-eNOS和NF-κB蛋白的表達 4組腦組織中p-AMPK、p-eNOS和NF-κB蛋白表達具有明顯差異(P<0.05)。Model組p-AMPK、p-eNOS蛋白表達低于Sham組，NF-κB蛋白表達高于Sham組，LEO組、NMDP組p-AMPK、p-eNOS蛋白表達高于Model組，NF-κB蛋白表達低于Model組，差異均具有統計學意義(P<0.05)；LEO組與NMDP組無明顯差異(P>0.05)，見表2、圖5。

表2 各組NF-κB熒光強度及腦組織p-AMPK、 p-eNOS、 NF-κB蛋白表達

圖5 Wetern印跡分析p-AMPK、 p-eNOS、NF-κB蛋白表達

3 討 論

AD起病遲緩且發病隱匿，屬于慢性神經退行性疾病，病理特征包括海馬神經元大量凋亡及死亡、Aβ沉積等，多表現為記憶減退、精神障礙及行為障礙等。目前AD發病機制尚未明確，積極采取有效治療藥物緩解AD患者病情進展是臨床亟待解決問題。中藥中的有效成分或單一成分在AD的治療中取得了一定的突破，LEO作為益母草的有效成分之一，具有活血解毒的功效，隨著研究的深入，LEO對腦神經具有良好的保護作用。據報道〔9〕，LEO預處理能夠明顯降低缺血缺氧導致的大鼠皮層神經元凋亡率。研究顯示〔10〕，LFO與SD大鼠皮質神經元存在潛在關聯，LEO能明顯改善局灶性腦缺血再灌注大鼠腦海馬區神經元細胞的線粒體功能，并且可以抑制局灶性腦缺血再灌注模型SH-SYSY細胞凋亡，提示LEO能夠保護海馬區缺血引發的神經元凋亡。另有學者研究證實，LEO能夠緩解腦震蕩引發的神經功能損傷，其大鼠模型腦水腫明顯改善〔11〕。本研究發現，LEO減輕AD對學習和記憶能力的損傷程度，減少神經元凋亡率，與上述研究結果一致。

研究表明，AD表現的認知功能障礙，與腦部能量代謝失衡有關。AMPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是能量代謝過程的關鍵調節因子。在細胞能量代謝過程中，AMPK主要負責平衡外圍能量，如果細胞能量減弱時，激活AMPK能夠維持細胞的新陳代謝穩定。所以，有學者稱之為平衡細胞能量的“介質”〔12〕。有報道稱〔13〕，AMPK的激活是大腦神經元修復過程的重要因素之一。eNOS是細胞氮元素代謝的重要參與者，受AMPK的影響，與神經元凋亡、再生密不可分。NF-κB在多種類型細胞中存在，尤其是神經系統神經元細胞和星形細胞〔14〕。是免疫平衡調節程序中重要的參與者。相關研究顯示，在高炎狀態下細胞核內存在活化后NF-κB，其能夠對多種編碼炎癥的靶基因展開調控作用，進而影響如IL-1β、IL-6 和 TNF-α等的表達，而高炎狀態下會導致腦神經損傷加深，上游AMPK/eNOS通路會抑制NF-κB的表達〔15〕。相關研究顯示〔16〕，腦梗死后神經細胞中AMPK/eNOS/NF-κB信號通路相關蛋白表達異常改變，進一步說明AMPK/eNOS/NF-κB信號通路參與腦細胞的修復和再生。本研究說明AD腦部的神經損傷與 AMPK/eNOS/NF-κB信號通路密切相關。LEO可能激活AMPK/eNOS通路，抑制NF-κB的活化發揮對AD大鼠腦組織的保護作用。