金銀花提取物通過激活Nrf2通路對急性肝損傷模型大鼠肝功能的保護作用

魯榮華 楊群 趙玲

(滕州市中心人民醫院 1感染病科，山東 滕州 277599；2功能檢查科)

核轉錄因子E2相關因子(Nrf)2通路是體內重要抗氧化應激通路，其在肝損傷、肺損傷等機體多種臟器損傷中發揮重要作用，目前已成為肝臟疾病重要潛在治療靶點〔1～4〕。金銀花具有清熱解毒、解暑化濕等作用，其有效成分中黃銅、綠原酸等是天然抗氧化劑，可清除體內超氧離子自由基，保護機體免受氧化損傷〔5，6〕。金銀花提取物(HFE)可改善肝臟病理損傷，降低血糖，改善小鼠胰島素抵抗〔7〕，但是否通過Nrf2抗氧化損傷通路發揮作用尚未可知。本研究采用四氯化碳(CCl4)誘導并建立急性肝損傷大鼠模型，以探究HFE對急性肝損傷大鼠的保護作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠 50只6周齡清潔級SD大鼠，雄性，體重200～220 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK(蘇)2016-0010，使用許可證號：SYXK(蘇)2017-0015。于20～25℃溫度，50%～70%濕度、12 h/12 h光照、黑暗條件下，自由采食，自由飲水。本研究經過醫院動物倫理學委員會批準通過。

1.2主要試劑及儀器 HFE(綠原酸含量6%)購自新鄉博凱生物技術有限公司；CCl4(貨號：48604)購自Sigma-Aldrich公司；大鼠丙二醛(MDA)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：ER1878)購自武漢菲恩生物科技有限公司；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒(貨號：YM-2972B)購自上海遠慕生物科技有限公司；大鼠谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)ELISA試劑盒(貨號：ZK-R4121)購自深圳子科生物科技有限公司；大鼠谷丙轉氨酶(ALT)ELISA試劑盒(貨號：ab234579)、谷草轉氨酶(AST)ELISA試劑盒(貨號：ab263883)、堿性磷酸酶(ALP)ELISA試劑盒(ab83259)、兔源一抗anti-Nrf2(貨號：ab137550)、anti-血紅素氧化酶(HO)-1(貨號：ab13243)、anti-β-actin(貨號：ab179467)，二抗羊抗兔IgG(貨號：ab205718)均購自英國Abcam公司；引物均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；ix73顯微鏡購自日本Olympus公司；MODEL550型酶標儀購自美國Bio-Rad公司等。

1.3方法

1.3.1模型制備及分組 50只SD大鼠隨機分為5組：對照組(NC組)、模型組(M組)、M+HFE組、M+Nrf2通路抑制劑ML385組(M+ML385組)、M+ ML385+HFE組，每組10只。M+HFE組給予HFE 62.5 mg/kg，約為人的臨床等效用量；M+ML385組給予ML385 30 mg/kg；M+ML385+HFE組給予ML385 30 mg/kg及HFE 62.5 mg/kg；NC組、M組灌胃等量蒸餾水，灌胃量均為5 ml/kg，連續干預4 w，各組灌胃最后1 d禁食16 h，除NC組外其余4組一次性腹腔注射0.12% CCl4花生油(1 ml/kg)誘導急性肝損傷模型〔8〕，NC組腹腔注射等量花生油，4 h后每組大鼠進行最后1次灌胃，之后禁食不禁水，24 h后腹主動脈采血，處死后取肝臟組織，部分置于液氮中保存備用，部分進行石蠟包埋保存備用。

1.3.2生化指標檢測 血液常規離心后收集血清，采用ELISA檢測各組大鼠血清肝功能指標ALT、AST、ALP水平；制備大鼠肝臟組織勻漿液，采用ELISA檢測各組大鼠肝臟組織氧化應激指標MDA、SOD、GSH-Px水平，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3肝臟組織病理學檢測 取各組大鼠部分肝臟組織石蠟包埋塊，以5 μm厚度進行切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝臟組織病理學形態變化。

1.3.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 采用Trizol提取肝臟組織總RNA，濃度及純度檢驗合格后制備cDNA，采用RT-qPCR法擴增Nrf2、HO-1 mRNA部分片段。Nrf2上游引物序列：5′-GGGCAAGCGACTCATGGTCAT-3′，下游引物序列：5′-AAGCTGCAT ACAGTCTTCAAA-3′；HO-1上游引物序列：5′-GATAGAGCGCAACAAGCAGAA-3′，下游引物序列：5′-CAGTGAGGCCCATACCAGAAG-3′；內參β-actin上游引物序列：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCA-3′，下游引物序列：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。反應體系(20 μl)：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0 μl，ROX Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，cDNA(50 ng/μl)2.0 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，雙蒸水(ddH2O) 6.0 μl。反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法定量分析肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA相對表達水平。

1.3.5Western印跡 提取各組大鼠肝臟組織總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，置于-80℃保存備用。取50 mg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉膜，室溫封閉，添加anti-Nrf2(1∶1 000)、anti-HO-1抗體(1∶2 000)、anti-β-actin抗體(1∶5 000)，4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，添加二抗羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，顯色，曝片，觀察結果并分析蛋白灰度值。

1.4統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組血清肝功能指標比較 與NC組比較，M組血清ALT、AST、ALP水平顯著增加(P<0.05)；與M組比較，M+HFE組血清ALT、AST、ALP水平顯著降低(P<0.05)，M+ML385組血清ALT、AST、ALP水平顯著增加(P<0.05)；M+HFE+ML385組血清ALT、AST、ALP水平顯著高于M+HFE組，顯著低于M+ML385組(P<0.05)，見表1。

表1 各組血清肝功能指標及肝臟組織氧化應激指標比較

2.2各組肝臟組織病理學形態變化 NC組肝臟小葉結構清晰，未見異常形態變化；M組肝臟組織多處融合壞死，肝細胞腫脹、變性，有大量炎性細胞浸潤；M+HFE組、M+HFE+ML385小葉結構尚存在，壞死灶減少；M+ML385組肝臟組織存在大量壞死灶，肝細胞變性、腫脹程度增加，見圖1。

圖1 各組肝臟組織病理學形態變化(HE染色，×200)

2.3各組肝臟組織氧化應激指標水平比較 與NC組比較，M組肝臟組織MDA含量顯著增加，SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與M組比較，M+HFE組肝臟組織MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px活性顯著增加(P<0.05)，M+ML385組肝臟組織MDA含量顯著增加，SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；M+HFE+ML385組肝臟組織MDA含量顯著高于M+HFE組，顯著低于M+ML385組(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性顯著低于M+HFE組，顯著高于M+ML385組(P<0.05)，見表1。

2.4各組肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA相對表達水平比較 與NC組比較，M組肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA表達水平顯著增加(P<0.05)；與M組比較，M+HFE組肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA表達水平顯著增加(P<0.05)，M+ML385組肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；M+HFE+ML385組肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA表達水平顯著低于M+HFE組，顯著高于M+ML385組(P<0.05)，見表2。

表2 各組肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA相對表達 水平比較

2.5各組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較 與NC組比較，M組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達量顯著增加(P<0.05)；與M組比較，M+HFE組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達量顯著增加(P<0.05)，M+ML385組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；M+HFE+ML385組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達量顯著低于M+HFE組，顯著高于M+ML385組(P<0.05)，見圖2、表3。

1～5：NC組、M組、M+HFE組、M+ML385組、M+HFE+ML38組圖2 Western印跡檢測各組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達

表3 各組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白 表達量比較

3 討 論

CCl4是一種無色有毒液體，主要通過刺激機體自由基過量形成，引起細胞壞死引發鏈式過氧化反應，可造成化學性器官損傷，其中以肝損傷最快速且最顯著，廣泛用于動物實驗中急慢性肝損傷動物模型的建立，簡單、易行、可靠且可重復性好〔9，10〕。本研究結果顯示，CCl4作用后產生大量氧自由基，抑制抗氧化酶產生，誘導脂質過氧化，提示CCl4誘導急性肝損傷模型大鼠制備成功。肝臟是機體最大的消化腺，是體內物質能量代謝中心，目前，臨床研究顯示，藥物引起的肝損傷危害性極大，因此對保肝藥物的篩選及作用機制探究具有重要意義。

金銀花又名忍冬、二花、銀花等，首次記載于《本草綱目》中，是一味傳統中藥，富含多種化學成分，其中綠原酸、異綠原酸等有機酸類化合物，金絲桃苷、木犀草素等黃酮類化合物均具有廣泛抗菌、消炎、抗病毒、抗氧化、免疫調節、護肝降糖等多種藥理作用〔11，12〕。有研究報道，HFE對乙醇導致小鼠化學性肝損傷有一定保護作用〔13〕，可能與通過增加血清抗氧化酶GSH-Px、SOD活性，降低MDA含量，提高機體抗氧化能力，保護機體細胞免受氧化應激損傷有關〔14〕。許萬紫等〔15〕報道，HFE可通過清除氧自由基，減輕氧化應激，保護小鼠心肌缺血再灌注損傷。本研究結果提示HFE可減輕CCl4誘導的大鼠急性肝損傷，可能與提高其抗氧化能力有關。

Nrf2通路激活與內源性抗氧化系統增強密切相關，正常生理條件下，Nrf2與Kelch樣ECH相關蛋白(Keap)1相耦聯位于細胞質中，無生物活性；而氧化應激發生時，Nrf2可發生磷酸化與Keap1解耦聯并轉移入核，進而與DNA上氧化反應元件(ARE)啟動HO-1、SOD、GSH-PX等下游抗氧化酶表達，引發抗氧化反應〔16，17〕。研究表明，Nrf2抗氧化通路在大鼠急性肝損傷中發揮重要保護作用，激活Nrf2信號通路可減輕化學性肝損傷，該通路可作為肝損傷治療靶點〔18～20〕。本研究結果提示HFE保護CCl4誘導的大鼠肝損傷作用可能與Nrf2通路激活有關。HFE可通過促進Nrf2通路激活減輕CCl4誘導的大鼠急性肝損傷，但HFE作為一種中藥提取物，可能具有多靶點活性，可能還通過調節其他相關通路共同發揮抗氧化作用，減輕肝損傷，但有待進一步探究。

綜上所述，HFE可通過促進Nrf2通路激活，發揮抗氧化應激作用，減輕CCl4誘導的大鼠急性肝損傷。但HFE作為一種中藥提取物，可能具有多靶點活性，在減輕肝損傷作用過程中還可能通過調節其他相關通路共同發揮抗氧化作用，有待進一步深入探究。