微生物發酵對口含煙煙葉煙堿與特有亞硝胺含量的影響

楊 靜， 李書貴， 楊 顏， 潘和平

(1.黔東南州煙草公司， 貴州 凱里 556000； 2.施秉縣煙草公司， 貴州 施秉 556200)

0 引言

【研究意義】煙堿(Nicotine)是影響煙葉品質的特征性指標之一[1]，煙堿的含量與煙民的健康密切相關，含量過高可能會對身體健康產生嚴重危害[2]。近年來，隨著國內外控煙形勢的日趨嚴峻，口含煙成為煙草工業企業的重要研究方向之一。口含煙產品質量安全監控的重要指標之一就是煙堿的釋放量[3]，同時煙堿對味覺具有很重要的影響，尤其在口含煙中，游離煙堿直接透過口腔黏膜被人體吸收刺激人腦多巴胺的產生從而增加人的滿足感[4]。煙葉煙堿含量偏高，導致入口使用時刺激性、辛辣味較重。降低煙堿含量有利于降低煙草原料的辛辣感，從而改善口含煙的刺激感。煙草中特有亞硝胺(Tobacco-specific nitrosamines，簡稱TSNA)是煙草特有的N-亞硝基類化合物，主要包含N-亞硝基去甲煙堿(NNN)和4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)等，是一組主要的致腫瘤物質[5]，是煙葉中重要的有害成分。因此，開展煙葉降害研究對提高煙草原料品質，促進煙草企業健康可持續發展具有重要意義。【前人研究進展】龍章德等[6]從植煙土壤中篩選到一株有效降解煙堿的微生物，并確定其最佳生長條件及其降解煙堿最大的發酵條件，在此條件下其降解率達82%。胡希[7]研究發現，微生物能夠降低雪茄煙總植物堿的含量。CHOPYK等[4,8-9]研究發現，微生物發酵對煙葉化學成分和評吸品質有一定的影響，能夠很好地降低煙葉煙堿含量，對提高香氣量改善香氣質有很好的作用。普遍認為煙草中TSNA是由煙草中的生物堿和亞硝鹽反應形成，因此亞硝酸鹽是生成亞硝胺的前提物之一，所以，降低煙葉中亞硝酸鹽含量有助于降低亞硝胺含量，提高口含煙的食用安全性。圍繞微生物對煙葉發酵降害作用，國內外學者已經進行了大量有益的探索，并取得了一定進展。有研究發現，微生物的存在對亞硝酸鹽含量產生顯著影響[10-11]，通過篩選降硝酸鹽微生物然后接種到煙葉進行發酵可降低煙葉中亞硝胺含量[12-21]。單宏英等[17]研究發現，醇化煙葉表面的熒光假單胞菌AS97能夠顯著降低煙草特有亞硝胺(TSNA)的含量。李雪梅等[18]從大量煙草內生細菌中篩選出一株能夠顯著降低煙草特有亞硝胺含量的菌株——銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginoseKenLXP30)，通過液體發酵制備成煙草降害生物制劑，可顯著降低白肋煙煙葉中的TSNA。雷麗萍等[19]篩選出短小芽孢桿菌，其對晾制煙葉發酵處理后TSNAs降低17.3%。趙麗萍等[20]從62個煙葉樣品中分離篩選出1株能以煙堿作為碳氮源和能源的11L140巴氏微桿菌，其具有明顯的降堿功能。張春花等[21]研究發現，利用微生物發酵能夠降低煙葉中農藥殘留。【研究切入點】從目前的應用情況看，大多數微生物煙葉發酵技術還處于摸索階段，尚未形成行之有效的適用工業化生產的煙葉發酵技術，且鮮見解淀粉芽孢桿菌(GUHP86)和枯草芽孢桿菌(B01)對煙草不同等級煙葉降害研究的報道。【擬解決的關鍵問題】采用連續流動分析儀和液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀(LC-MS-MS)測定解淀粉芽孢桿菌GUHP86和枯草芽孢桿菌B01發酵云煙87不同等級部位煙草原料的煙堿和特有亞硝胺NNN、NNK含量的變化，以期為其在口含煙煙葉提質降害上的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 口含煙原料煙葉 選取貴州省黔東南州煙區生產的云煙87的下橘二(X2F)、中橘三(C3F)和上橘二(B2F)3個部位的煙葉，用清水洗凈后分別放入40℃以下烘箱中低溫烘干，粉碎密封保存備用。

1.1.2 微生物 解淀粉芽孢桿菌GUHP86和枯草芽孢桿菌B01，由貴州大學釀酒與食品工程學院實驗室提供。

1.1.3 發酵培養基 自制。含胰蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、NaCl 10 g及葡萄糖1 g，補充蒸餾水至1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min備用。

1.1.4 有糖鹽溶液 自制。MgCl20.5 g、KCl 0.5 g、CaCl220.5 g、NaCl 0.5 g、葡萄糖2 g，補充蒸餾水至1 000 mL，溶解滅菌后備用。

1.1.5 儀器與設備 多通道連續流動分析儀、三維隨機自動取樣器、高精度蠕動、泵雙光束比色計，AA3德國SEAL公司；液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀(LC-MS/MS)，美國Thermofisher公司；Waters Xterra C8s色譜柱50 mm×2.1 mm，粒徑3.5 μm，Waters公司；DQ8純水、超純水一體系統，法國默克公司。

1.2 方法

1.2.1 制備種子液 準確稱取胰蛋白胨1.25 g、酵母提取物0.625 g、NaCl 6.25 g、葡萄糖0.625 g加入1 000 mL容量瓶定容至刻度，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，待冷卻后接入菌種，180 r/min、37℃培養18 h。解淀粉芽孢桿菌GUHP86種子液活菌濃度為9.58 CFU/mL、枯草芽孢桿菌B01種子液活菌濃度為9.56 CFU/mL。在無菌操作臺中將培養好的菌株分別放入均等的大離心管中，于1 350 r/min離心10 min。離心以后，倒出上清液，保留菌體，然后加入20 mL滅菌生理鹽水，搖勻備用。

1.2.2 煙草原料發酵 試驗設3個處理：T1，煙葉分別加入20% GUHP86+20%有糖鹽溶液，37℃發酵20 d；T2，加入30% B01+25%有糖鹽溶液，37℃發酵20 d；空白對照(CK)，不添加微生物進行發酵。分別稱取3個部位(X2F、C3F和B2F)的煙葉粉末各20 g分別裝入14 cm×10 cm的無菌密封袋，滅菌。按試驗設計吸取適量離心管內菌液于煙粉塑封袋內，適量加入鹽溶液，充分混勻，貼上標簽放入恒溫培養箱內進行發酵，每天需進行換氣，分別取0 d、5 d、10 d、15 d和20 d的發酵煙草原料，將煙粉在115℃下滅菌20 min后[22-23]，測定煙堿及特有亞硝酸鹽含量。

1.2.3 樣品檢測 煙堿參照《煙草及煙草制品總植物堿的測定 連續流動法》(YC/T 468—2013)[23]進行測定。特有亞硝胺參照文獻[24-26]的方法采用液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀定量分析檢測。

2 結果與分析

2.1 不同微生物發酵各部位煙葉的煙堿含量

從圖1看出，3個部位煙葉的煙堿含量隨各微生物發酵時間延長均呈慢快慢下降趨勢。

2.1.1 X2F 發酵0～10 d時各處理煙葉的煙堿含量均緩慢下降，T1下降最多，降解率為5.95%；T2其次，降解率為5.00%；CK最少，降解率為2.73%。發酵10～15 d時T1和T2的煙堿含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時T1和T2較0 d時分別下降17.30%和11.11%，均較CK(6.01%)降解快。發酵15～20 d時，煙堿含量又恢復緩慢下降趨勢，至20 d時，T1、T2和CK較0 d時分別下降19.46%、15.00%和7.65%，T1下降最多，T2次之。

2.1.2 C3F 發酵0～10 d時各處理煙葉的煙堿含量均緩慢下降，T2下降最多，降解率為9.25%；T1其次，降解率為5.50%；CK最少，降解率為3.05%。發酵10～15 d時T1和T2的煙堿含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時T1和T2較0 d時分別下降38.14%和33.81%，T1的降速大于T2，二者均較CK(5.61%)降解快。發酵15～20 d時，煙堿含量又恢復緩慢下降趨勢，至20 d時，T1、T2和CK較0 d時分別下降40.89%、38.43%和8.77%，T1下降最多，T2次之。

2.1.3 B2F 發酵0～10 d時各處理煙葉的煙堿含量均緩慢下降，T1下降最多，降解率為9.33%；T2其次，降解率為6.92%；CK最少，降解率為5.09%。發酵10～15 d時T1和T2的煙堿含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時T1和T2較0 d時分別下降44.04%和40.00%，均較CK(6.97%)降解快。發酵15～20 d時，煙堿含量又恢復緩慢下降趨勢，至20 d時，T1、T2和CK較0 d時分別下降50.78%、44.36%和8.58%，T1下降最多，T2次之。

總體看，T1對煙堿的降解效果最好，T2次之，2種微生物的降解效果集中在發酵后10～15 d，最佳發酵時間為15 d。

2.2 不同微生物發酵各部位煙葉的特有亞硝酸鹽含量

2.2.1 N-亞硝基去甲煙堿(NNN) 從圖2看出，3個部位煙葉的NNN含量隨不同微生物發酵時間延長均呈慢快慢降低趨勢。

1) B2F。發酵0～10 d時各處理煙葉的NNN含量均緩慢下降，T2下降最多，降解率為19.96%；T1其次，降解率為17.42%；CK最少，降解率為5.27%。發酵10～15 d時T1和T2的NNN含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時T1和T2較0 d時分別下降51.49%和42.98%，T1的降速超過T2，二者均均較CK(5.82%)降解快。發酵15～20 d時，NNN含量又恢復緩慢下降趨勢，至20 d時，T1、T2和CK較0 d時分別下降64.39%、55.59%和7.58%，T1下降最多，T2次之。

2) C3F。發酵0～10 d時各處理煙葉的NNN含量均緩慢下降，T2下降最多，降解率為19.44%；T1其次，降解率為14.33%；CK最少，降解率為3.94%。發酵10～15 d時T1和T2的NNN含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時T1和T2較0 d時分別下降54.27%和44.31%，T1的降速超過T2，二者的降速均超過CK(6.19%)。發酵15～20 d時，NNN含量又恢復緩慢下降趨勢，至20 d時，T1、T2和CK較0 d時分別下降59.62%、54.86%和7.45%，T1下降最多，T2次之。

3) X2F。發酵0～10 d時各處理煙葉的NNN含量均緩慢下降，T2下降最多，降解率為8.54%；T1其次，降解率為7.78%；CK最少，降解率為4.21%。發酵10～15 d時T1和T2的NNN含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時T1和T2較0 d時分別下降19.26%和25.27%，均較CK(5.61%)降解快。發酵15～20 d時，NNN含量又恢復緩慢下降趨勢，至20 d時，T1、T2和CK較0 d時分別下降28.15%、35.23%和7.02%，T2下降最多，T1次之。

總體看，T1對B2F和C3F煙葉NNN的降解效果最好，對X2F的降解效果次于T2；2種微生物的降解效果集中在發酵后10～15 d，最佳發酵時間為15 d。

2.2.2 4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK) 從圖3看出，3個部位煙葉的NNK含量隨不同微生物發酵時間延長均呈慢快慢下降趨勢。

1) B2F。發酵10 d時各處理煙葉的NNK含量下降4.29%～29.41%，T1下降最多，T2其次，降解率為26.23%，CK最少。發酵10～15 d時T1和T2的NNK含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時T1和T2較0 d時分別下降60.78%和59.57%，均較CK(5.26%)降解快。發酵15～20 d時，NNK含量又恢復緩慢下降趨勢，至20 d時，T1、T2和CK較0 d時分別下降63.73%、65.68%和8.38%，T2下降最多，T1次之。

2) C3F。發酵10 d時各處理煙葉的NNK含量下降3.59%～11.86%，T1下降最多，T2其次，降解率為11.61%，CK最少。發酵10～15 d時T1和T2的NNK含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時T1和T2較0 d時分別下降54.55%和32.21%，均較CK(5.98%)降解快。發酵15～20 d時，T1的NNK含量呈緩慢下降趨勢，而T2的NNK含量仍呈快速下降趨勢；至20 d時，T1、T2和CK較0 d時分別下降58.50%、55.43%和7.97%，T1下降最多，T2次之。

3)X2F。發酵10 d時各處理煙葉的NNK含量下降2.16%～9.04%，T1下降最多，T2其次，降解率為4.44%，CK最少。發酵10～15 d時T1和T2的NNK含量急劇下降，CK仍下降緩慢，至15 d時T1和T2較0 d時分別下降27.68%和32.22%，T2的降速超過T1，均較CK(5.94%)降解快。發酵15～20 d時，NNK含量又恢復緩慢下降趨勢，至20 d時，T1、T2和CK較0 d時分別下降33.33%、41.67%和7.57%，T2下降最多，T1次之。

總體看，T2對B2F和X2F煙葉NNK的降解效果最好，對C3F的降解效果次于T1；2種微生物的降解效果集中在發酵后10～15 d，最佳發酵時間為15 d。

3 討論

口含煙是煙草以粉末形式在口腔中使用，煙草的煙堿等成分溶出后通過口腔黏膜吸收。因直接入口腔，口含煙對煙草原料品質安全要求苛刻，其品質直接決定口含煙產品的風味特色和使用安全性。而一般新烤的煙葉具有很重的青雜氣，煙堿含量大、刺激性高，且含有對人體健康造成不良影響的煙草特有亞硝胺。目前已可以使用發酵醇化技術改進上述缺陷。單宏英等[17-19]分別證明熒光假單胞菌AS97、銅綠假單胞菌和短小芽孢桿菌均可顯著降低煙草的TSNA含量。趙麗萍等[20]從62個煙葉樣品中分離篩選出1株能以煙堿作為碳氮源和能源的11L140巴氏微桿菌，其具有明顯的降堿功能。該研究結果表明，解淀粉芽孢桿菌GUHP86和枯草芽孢桿菌B01均具有降煙堿和特有亞硝胺的作用，與前人的研究結果類似。解淀粉芽孢桿菌GUHP86的降解效果較枯草芽孢桿菌B01好，可能是GUHP-86發酵煙葉時生成了具納豆激酶活力和蛋白酶活力等對人體有益的酶[27]，起到促進煙堿降解的作用。不同部位降解率不一樣，可能是因為其內涵物質及含量不同，也可能是因為煙草中特有亞硝胺與煙堿含量呈極顯著正相關[28-29]，具體還有待進一步探索。

4 結論

解淀粉芽孢桿菌GUHP86和枯草芽孢桿菌B01均具有一定的降煙堿作用，發酵20 d時，解淀粉芽孢桿菌GUHP86對不同部位煙葉煙堿的降解率存在差異，表現為B2F(50.78%)>C3F(40.89%)>X2F(19.46%)，枯草芽孢桿菌B01降解效果次于GUHP86，其對不同部位煙葉的降解率也不同，表現為B2F(44.36%)>C3F(38.43%)>X2F(15.00%)。解淀粉芽孢桿菌GUHP86降煙堿的效果較枯草芽孢桿菌B01好，2種微生物最佳發酵時間為10～15 d；發酵15 d時，2種微生物對不同部位煙葉煙堿的降解率分別為X2F 17.30%和11.11%，C3F 38.14%和33.81%，B2F 44.04%和40.00%。

解淀粉芽孢桿菌GUHP86和枯草芽孢桿菌B01均能降低煙草原料的特有亞硝胺NNN和NNK含量，GUHP86對NNN的降解率表現為B2F(64.39%)>C3F(56.73%)>X2F(28.15%)，B01對NNN的降解率表現為B2F(55.60%)>C3F(54.86%)>X2F(53.23%)；GUHP86對NNK的降解率表現為B2F(63.73%)>C3F(59.28%)>X2F(33.33%)，B01對NNK的降解率表現為B2F(65.68%)>C3F(55.43%)>X2F(41.67%)，表明，GUHP86和B01對B2F特有亞硝胺NNN和NNK的降解率最高，C3F次之，X2F最低，降解效果最好的時間段為發酵后10～15 d，發酵15 d時，2種微生物對不同部位煙葉NNN的降解率分別為B2F 51.49%和42.98%，C3F 54.27%和44.31%，X2F 19.26%和25.27%，GUHP86對B2F和C3F煙葉NNN的降解效果較B01好，對X2F的降解效果次于B01；NNK降解率分別為B2F 60.78%和59.57%，C3F 54.55%和32.21%，X2F 27.68%和32.22%，B01對B2F和X2F煙葉NNK的降解效果較GUHP86好，對C3F的降解效果次于GUHP86。