結直腸癌組織LncRNA MEG3、miR-31表達及與病理特征的相關性

趙 芝，張 剛，李哲麗，劉玉鳳，鄭少華，劉 楠

結直腸癌是現階段我國發病率、病死率較高的惡性腫瘤[1]。病理特征是影響結直腸癌患者治療決策、復發、預后的重要因素，因此研究影響其病理特征的分子標志物意義重大[2-3]。微小RNA可調節機體多種細胞功能，在結直腸癌等多種惡性腫瘤中均可檢測到微小RNA表達異常[4-5]。在體外細胞實驗中，結直腸癌細胞微小RNA-31(miR-31)表達升高，并發現與結直腸癌化療抗性有關，但其在人體結腸癌組織與癌旁組織中表達的研究少見，是否與病理特征有關尚不明確[6-7]。長鏈非編碼RNA母系印記基因3(LncRNA MEG3)是異源非編碼RNA，靶基因預測結果顯示LncRNA MEG3與miR-31的3' 端非翻譯區(3'UTR)存在結合位點，二者結合后可調控頭頸部腫瘤細胞的增殖、侵襲等行為，被認為是診斷和評估頭頸部癌癥患者預后的生物學標志物[8]。而在結直腸癌患者中，LncRNA MEG3對miR-31的靶向作用及對病理特征的影響尚無相關報道。故本研究通過檢測結直腸癌組織與癌旁組織LncRNA MEG3、miR-31表達，并分別經LncRNA MEG3過表達及抑制miR-31表達分析二者靶向調控作用及對病理特征的影響，從臨床和基礎細胞實驗角度，為進一步闡明結直腸癌侵襲性等生物學行為提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月—2021年10月我院收治的85例結直腸癌，其中男46例，女39例；年齡44～76(57.15±6.34)歲；腫瘤直徑≤5 cm 46例，>5 cm 39例；T1期20例，T2期22例，T3期24例，T4期19例；N0期23例，N1期33例，N2期29例；M0期58例，M1期27例；低分化46例，中分化24例，高分化15例。

1.2入組標準 納入標準：符合結直腸癌診斷標準[9]；首次確診，既往無癌癥相關治療史；年齡>18歲；自愿簽署本研究知情同意書。排除標準：轉移性結直腸癌者；伴有其他系統惡性腫瘤者；無法明確腫瘤分期者。

1.3研究方法

1.3.1主要試劑：LncRNA MEG3 mimic及陰性轉染質粒、LncRNA MEG3抑制劑(anti-LncRNA MEG3)均購自廣州易錦生物技術有限公司；杜氏改良培養基(DMEM)購自美國Gibco公司；miR-31 siRNA(si-miR-31)與陰性對照siRNA(si-NC)均購自美國Invitrogen公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自上海陽光生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3.2LncRNA MEG3、miR-31檢測：取活檢或術中切除的結直腸癌組織、癌旁組織標本，采用實時熒光定量PCR檢測LncRNA MEG3、miR-31表達，Trizol法提取細胞總RNA，反轉錄RNA得到cDNA，上機行PCR，反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40次。采用比較閾值法定量分析數據，LncRNA MEG3以GAPDH為內參基因，miR-31以U6為內參基因，檢測基因相對表達量=2-ΔΔCt。

1.3.3細胞轉染及分組：結直腸癌SW480細胞培養于DMEM培養基，待細胞生長融合為60%～70%時傳代。收集對數生長期細胞，胰蛋白酶消化后制備細胞懸浮液接種至6孔細胞培養板，放置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，細胞生長融合至30%時進行轉染，轉染前更換為不含胎牛血清的DMEM培養基，分別用anti-miR-NC、anti-LncRNA MEG3、miR-NC、LncRNA MEG3 mimic轉染結直腸癌SW480細胞，并依此分為anti-miR-NC組、anti-LncRNA MEG3組、miR-NC組、LncRNA MEG3組。

1.3.4熒光素酶報告基因檢測LncRNA MEG3靶基因：利用TargetScan等靶基因數據庫預測LncRNA MEG3與miR-31 3'UTR存在結合位點，將含有LncRNA MEG3結合位點的miR-31 3'UTR片段插入熒光素酶報告基因載體，構建WT-miR-31與MUT-miR-31 3'UTR熒光素酶報告載體。將熒光素酶報告載體WT-miR-31、MUT-miR-31分別與LncRNA MEG3 mimic、miR-NC共轉染SW480細胞，轉染36 h后收集細胞，根據熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測SW480細胞相對熒光素酶活性。

2 結果

2.1不同組織中LncRNA MEG3與miR-31表達比較 癌組織LncRNA MEG3表達低于癌旁組織，miR-31表達高于癌旁組織(P<0.01)。見表1。

表1 結直腸癌患者中不同組織LncRNA MEG3與miR-31表達比較

2.2LncRNA MEG3與miR-31表達的相關性 Pearson相關性分析顯示，LncRNA MEG3與miR-31表達呈負相關(r=-0.718，P<0.01)。見圖1。

圖1 結直腸癌患者LncRNA MEG3與miR-31相關性

2.3LncRNA MEG3對miR-31的靶向調控作用觀察 為明確LncRNA MEG3是否可靶向調控miR-31表達，分別將miR-NC、LncRNA MEG3 mimic與WT-miR-31、MUT-miR-31共轉染至SW480細胞中，熒光素酶報告基因檢測結果顯示，LncRNA MEG3 mimic可明顯抑制WT-miR-31的熒光素酶活性(P<0.05)，但LncRNA MEG3 mimic對MUT-miR-31的熒光素酶活性無明顯抑制作用(P>0.05)，見表2。將anti-miR-NC、anti-LncRNA MEG3分別轉染至SW480細胞，采用實時熒光定量PCR法分別檢測LncRNA MEG3過表達及沉默LncRNA MEG3表達后SW480細胞中miR-31表達變化，結果顯示LncRNA MEG3組SW480細胞中miR-31表達顯著降低，anti-LncRNA MEG3組SW480細胞中miR-31表達顯著升高(P<0.05)。見表3。

2.4不同病理特征患者LncRNA MEG3與miR-31表達比較 不同T分期、N分期、M分期、分化程度患者LncRNA MEG3與miR-31表達比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 不同病理特征結直腸癌患者LncRNA MEG3與miR-31表達比較

2.5LncRNA MEG3、miR-31表達與病理特征的相關性 LncRNA MEG3表達與T、N分期呈負相關(r=-0.737、-0.725，P<0.01)，與分化程度呈正相關(r=0.824，P<0.01)；miR-31表達與T、N分期呈正相關(r=0.830、0.748，P<0.01)，與分化程度呈負相關(r=-0.742，P<0.01)。見圖2。

圖2 結直腸癌患者LncRNA MEG3、miR-31表達與病理特征的相關性

3 討論

微小RNA表達異常可引起腫瘤等多種疾病發生，隨著生物信息技術發展，微小RNA成為腫瘤治療靶點[10]。部分微小RNA發揮促癌基因作用，其在腫瘤組織或細胞中高表達，下調微小RNA表達已成為腫瘤治療研究的新方向[11]。本研究結果顯示，結直腸癌組織miR-31表達高于癌旁組織，與既往報道一致[12]，提示miR-31可能為結直腸癌促癌基因。miR-31高表達能通過靶向張力蛋白1，影響免疫浸潤，促進結直腸癌細胞惡性生物學行為[13]。

本研究不同T、N、M分期及分化程度患者miR-31表達比較差異有統計學意義，且miR-31與T、N分期呈正相關，與分化程度呈負相關，提示miR-31與結直腸癌患者病理特征有關，miR-31高表達預示著更強的腫瘤侵襲性。CUI[14]研究發現，有淋巴結轉移和遠處轉移的結直腸癌患者miR-31表達水平高于無淋巴結轉移和遠處轉移患者；MOLOUDIZARGARI等[15]研究顯示，miR-31是預測結直腸癌預后的標志物。

LncRNA MEG3能調控細胞周期、增殖、凋亡等多種細胞活動，在腫瘤細胞中，因LncRNA MEG3啟動子甲基化或甲基化位點小片段缺失，造成LncRNA MEG3表達降低或基因沉默，導致正常細胞異常增殖發生癌變[16]。本研究發現，與癌旁組織比較，癌組織LncRNA MEG3表達明顯降低，且不同病理特征患者LncRNA MEG3表達存在顯著差異，LncRNA MEG3與T分期、N分期呈負相關，與分化程度呈正相關，提示LncRNA MEG3在結直腸癌中起抑癌基因作用。LncRNA MEG3高表達能修復DNA損傷，保護內皮功能[17]。沉默LncRNA MEG3可導致Nocth信號通路活化，促進骨肉瘤細胞增殖，并抑制其凋亡，揭示LncRNA MEG3的抑癌作用[18]。

CHEN等[19]報道，LncRNA MEG3是通過海綿化miR-421抑制口腔癌干細胞的自我更新和侵襲能力。XU等[20]研究發現，LncRNA MEG3通過海綿化miR-147抑制細胞的增殖、遷移。可見LncRNA MEG3在腫瘤中的抑癌作用可通過調控微小RNA來實現。本研究結果顯示，抑制LncRNA MEG3后，結直腸癌SW480細胞中miR-31表達升高，LncRNA MEG3過表達后結直腸癌SW480細胞中miR-31表達降低，行熒光素酶報告基因檢測發現，LncRNA MEG3可特異性結合miR-31，負向調控miR-31表達，并進一步影響結直腸癌患者病理特征，從而參與結直腸癌的發生發展過程。

綜上，結直腸癌組織中LncRNA MEG3呈低表達，miR-31呈高表達，且LncRNA MEG3可特異性結合miR-31，負向調控miR-31表達，影響結直腸癌患者病理特征，可為揭示結直腸癌侵襲性、靶向治療等提供新思路。