腫瘤壞死因子-β基因多態(tài)性與大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死的相關(guān)性*

劉利寧，李毓新，王曉芳

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 710038

腦梗死是臨床常見病，其發(fā)病率高、致殘率高、病死率高，一直為研究熱點(diǎn)。在該病的病理生理過程中，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和進(jìn)展發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。近年來,國(guó)外一些研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-β(TNF-β)A252G、C804A基因多態(tài)性可影響TNF-β的表達(dá)水平，進(jìn)而與動(dòng)脈粥樣硬化性疾病相關(guān)[2-3]。本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析技術(shù)和聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法(PCR-SSP)對(duì)本地區(qū)部分大動(dòng)脈粥樣硬化型(LAA)腦梗死患者及健康對(duì)照者的TNF-β A252G、C804A位點(diǎn)基因進(jìn)行檢測(cè)分型，旨在探索該基因多態(tài)性與LAA腦梗死發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2016年9-12月收治的80例LAA腦梗死住院患者為腦梗死組。患者全部符合《各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)》中腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)，全部病例均經(jīng)臨床、頭部CT及頭部MRI掃描證實(shí)，且行腦血管評(píng)估(頸動(dòng)脈B超+頭磁共振血管造影、頭+頸部CT血管造影或腦數(shù)字剪影血管造影)證實(shí)TOAST分型為L(zhǎng)AA，并排除腦梗死出血性轉(zhuǎn)化以及合并多臟器功能不全、風(fēng)濕免疫性疾病、感染性疾病。其中男42例，女38例；年齡40～75歲，平均(61.2±7.9)歲；體質(zhì)量指數(shù)20.0～26.3 kg/m2，平均(22.9±2.9)kg/m2；病程≤1周，神經(jīng)功能缺損評(píng)分(NIHSS評(píng)分)：4～15分。對(duì)照組80例，為本院同一時(shí)期在門診體檢的健康人群，無腦梗死、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病病史，經(jīng)頸動(dòng)脈B超證實(shí)無頸動(dòng)脈粥樣硬化，并排除風(fēng)濕免疫性疾病以及近2周內(nèi)發(fā)生過炎性病變。其中男40例，女40例；年齡45～72歲，平均(58.0±8.7)歲；體質(zhì)量指數(shù)20.1～26.0 kg/m2，平均(22.5±2.4)kg/m2。兩組患者的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1臨床資料 通過問診和體格檢查收集研究對(duì)象的臨床資料，包括有無高血壓、糖尿病病史，有無吸煙、飲酒史，并抽血檢測(cè)以下生化指標(biāo)：空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血同型半胱氨酸(Hcy)。

1.2.2DNA提取 取臨床采集的外周血樣本1.0 mL，以枸櫞酸抗凝，用血液基因組DNA分離試劑盒(TIANGEN公司)分離白細(xì)胞的基因組DNA，操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成 應(yīng)用Primer 5軟件，參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)TNF-β A252G基因引物，P1：5′-AGA GCT GGT GGG GAC ATG TCT G-3′；P2：5′-CCG TGC TTC GTG CTT TGG ACT A-3′。P1、P2擴(kuò)增第1內(nèi)含子至第3外顯子的一段基因，長(zhǎng)度為740 bp。參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)TNF-β C804A基因引物，F(xiàn)1：5′-ACC ACC TGA ACG TCT CTT CCT-3′；R1：5′- GTG AGC AGC AGG TTT GAG GTA-3′，用于檢測(cè)A位點(diǎn)；F2：5′-GCA TCT TGC CCA CAG CAC-3′；R2：5′-GGC ACT GAA CAA CTG AGT TCC-3′，用于檢測(cè)C位點(diǎn)。

1.2.4PCR反應(yīng)體系 (1)A252G位點(diǎn)基因分型檢測(cè)采用PCR-RFLP方法：擴(kuò)增體系為25 μL，含100 ng模板DNA，10 pmol引物P1、P2，2×Taq Platinum PCR Master Mix(TIANGEN公司)，去離子水。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性6 min，按以下條件循環(huán)30次，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。末次循環(huán)后，72 ℃再延伸7 min。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入10 U NcoⅠ(Takara公司)，于37 ℃孵育2 h。(2)C804A位點(diǎn)基因分型檢測(cè)采用PCR-SSP方法：擴(kuò)增體系為25 μL，含100 ng模板DNA，10 pmol引物F1、R1，F(xiàn)2、R2，2×Taq Platinum PCR MasterMix(TIANGEN公司)，去離子水。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，按以下條件循環(huán)30次，95 ℃變性1 min，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min。末次循環(huán)后，72 ℃再延伸5 min。

1.2.5PCR-RFLP產(chǎn)物分析 酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析判讀。

1.2.6PCR-SSP產(chǎn)物分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析判讀。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床資料比較 腦梗死組中合并高血壓、糖尿病、吸煙史患者所占比例顯著高于對(duì)照組(χ2=30.83、10.46、8.03，P<0.05)；腦梗死組中FBG水平顯著高于對(duì)照組(t=-3.21,P<0.05)；兩組中有飲酒史者所占比例、TC、TG、LDL-C、Hcy水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2基因型的確定

2.2.1TNF-β A252G基因型確定 GG型，擴(kuò)增的基因片段含有NcoⅠ酶切位點(diǎn)，可被完全酶切為555、185 bp；GA型，產(chǎn)生不完全酶切，出現(xiàn)740、555、185 bp共3條帶；AA型，不產(chǎn)生酶切，電泳后只出現(xiàn)740 bp條帶。見圖1。

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖1 TNF-β A252G基因酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2.2TNF-β C804A基因型確定 CC型為218 bp，CA型為218、279 bp，AA型為279 bp。見圖2。

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖2 TNF-β C804A基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3基因型頻率、等位基因頻率分析 腦梗死組TNF-β A252G中GG的基因型頻率高于對(duì)照組(P<0.05)；AA基因型頻率低于對(duì)照組(P<0.05)；G的等位基因頻率在腦梗死組中高于對(duì)照組(P<0.05)；A的等位基因頻率低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。TNF-β C804A中AA基因型頻率在腦梗死組中高于對(duì)照組(P<0.05)；A的等位基因頻率高于對(duì)照組(P<0.05)；CC基因型頻率、C的等位基因頻率低于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表2 TNF-β A252G基因多態(tài)性比較[n(%)]

表3 TNF-β C804A基因多態(tài)性比較[n(%)]

2.4影響LAA腦梗死發(fā)生的多因素分析 將腦梗死作為因變量，高血壓、糖尿病、吸煙史、FBG水平、TNF-β A252G基因型分布、TNF-β C804A基因型分布為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，高血壓、糖尿病、吸煙史、FBG水平、TNF-β A252G基因型為GG型、TNF-β A252G等位基因?yàn)镚型、TNF-β C804A基因型為AA型、TNF-β C804A等位基因?yàn)锳型是LAA腦梗死發(fā)生的危險(xiǎn)因素。見表4。

表4 影響LAA腦梗死發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

TNF-β是淋巴細(xì)胞在抗原或有絲分裂原刺激下分泌的一種重要的促炎細(xì)胞因子。SCHREYER等[6]應(yīng)用免疫組化染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)TNF-β在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)廣泛表達(dá)；與此同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)與野生鼠相比，TNF-β基因敲除小鼠形成的動(dòng)脈粥樣硬化損傷體積減少為原來的62%[6]。QIAN等[7]研究顯示，給予ApoE基因敲除小鼠短時(shí)間注射重組人TNF-β拮抗劑可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化病變。這些研究均提示TNF-β作為一種致炎因子，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展中，起著重要的作用。其主要途徑為通過激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、E選擇素(E-selectin)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等高表達(dá)，使得白細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮細(xì)胞，并向血管內(nèi)膜下間隙遷移，釋放大量活性氧和彈性蛋白酶，繼而損傷血管壁[7-8]。

TNF-β基因位于染色體6p21(MHCⅢ類基因區(qū))內(nèi)，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。A252G基因位于TNF-β基因第1內(nèi)含子+252位點(diǎn)，當(dāng)堿基為G時(shí),產(chǎn)生了NcoⅠ的識(shí)別位點(diǎn),能被NcoⅠ限制性內(nèi)切酶識(shí)別切斷，該基因稱為TNF-β*1，當(dāng)堿基為A時(shí)，改變了NcoⅠ位點(diǎn)，該基因稱為TNF-β*2。C804A基因位于TNF-β基因第3外顯子+804位點(diǎn)，該位點(diǎn)存在1個(gè)C到A突變的單核苷酸多態(tài)性，可導(dǎo)致密碼子26編碼的氨基酸由蘇氨酸變?yōu)樘於彼?。MESSER等[9]認(rèn)為A252G能導(dǎo)致TNF-β表達(dá)水平升高，TANAKA等[10]亦發(fā)現(xiàn)252A/G突變后可使TNF-β的轉(zhuǎn)錄活性提高1.5倍，且他還證實(shí)了804C/A突變后血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生VCAM-1、E-selectin的能力可提高2倍。故本研究選取LAA腦梗死患者為主要研究對(duì)象，進(jìn)行TNF-β A252G、C804A基因多態(tài)性分析，探討它們之間的相關(guān)性。

已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)TNF-β A252G、C804A基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性進(jìn)行研究，但結(jié)論尚不統(tǒng)一。ZHAO等[11]在漢族中選取了1 124例腦梗死患者和1 163例健康對(duì)照者檢測(cè)分析TNF-β A252G基因多態(tài)性分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A252G基因頻率增高是無高血壓缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)因子。UM等[12]在對(duì)294例腦梗死患者和581例健康對(duì)照者進(jìn)行的TNF-β A252G基因多態(tài)性分析中卻發(fā)現(xiàn)腦梗死患者AA基因型頻率較健康者增高(χ2=6.991，P=0.03)，可能的機(jī)制為該基因型導(dǎo)致了TNF-α、白細(xì)胞介素(IL)-6等經(jīng)典炎癥因子的高表達(dá)[13]。與上述結(jié)果不同，F(xiàn)ASIHI等[14]在伊朗東北部地區(qū)進(jìn)行了類似研究，選取了186例LAA腦梗死患者，結(jié)果未能發(fā)現(xiàn)TNF-β A252G與腦梗死的相關(guān)性。除此之外，為探究TNF-β C804A與腦梗死是否具有相關(guān)性，TROMPET等[15]對(duì)5 389例合并多種心腦血管疾病危險(xiǎn)因素的人群進(jìn)行跟蹤隨訪研究，結(jié)果顯示，攜帶TNF-β C804A基因可能增加男性腦梗死的發(fā)生率，且基因型AA與基因型CA相比發(fā)生腦梗死風(fēng)險(xiǎn)更高(HR：2.07vs.1.43)。近年來還有部分研究對(duì)腦梗死患者同時(shí)進(jìn)行TNF-β A252G、C804A基因多態(tài)性的分析。KUMAR等[5]在印度北部地區(qū)收集了250例腦梗死患者的外周血液標(biāo)本，分析TNF-β A252G、C804A的基因多態(tài)性，最終得出結(jié)論：TNF-β A252G、C804A基因多態(tài)性與總卒中風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性，但A252G基因多態(tài)性與小動(dòng)脈閉塞型腦梗死具有相關(guān)性。而SZOLNOKI等[16]研究則顯示TNF-β A252G與C804A為共存關(guān)系，同時(shí)承載A252G、C804A的單體型為大動(dòng)脈粥樣硬化型CI的遺傳易感因素，但與小動(dòng)脈閉塞型腦梗死無明顯相關(guān)性。盡管如此，HAGIWARA等[17]抽取日本地區(qū)1 044例腦梗死患者和1 044例健康對(duì)照者進(jìn)行TNF-β A252G、C804A基因多態(tài)性分析，卻發(fā)現(xiàn)兩者缺乏相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，腦梗死組TNF-β A252G、C804A基因型分布與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中TNF-β A252G的GG、TNF-β C804A的AA基因型頻率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。除此之外，本研究還比較了TNF-β A252G、C804A等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)腦梗死組TNF-β A252G的G、TNF-β A804A的A等位基因頻率亦顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。由于在臨床資料比較中，腦梗死組合并高血壓、糖尿病、吸煙史的患者所占比例及FBG水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而這些因素為腦血管病傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，需進(jìn)一步采用Logistic回歸分析，規(guī)避上述因素對(duì)研究結(jié)果的干擾，結(jié)果仍提示TNF-β A252G基因型為GG型、等位基因?yàn)镚型、TNF-β C804A基因型為AA型、等位基因?yàn)锳型是LAA腦梗死發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=2.29、1.79、2.23、1.74)。上述結(jié)果說明TNF-β A252G的GG、TNF-β C804A的AA基因型可能是LAA腦梗死的易感基因，攜帶此基因型會(huì)增加LAA腦梗死的易感性，可能的機(jī)制為這些基因型或等位基因?qū)е铝薚NF-β的高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。除此之外，這兩個(gè)基因座位具有連鎖不平衡性(LD)，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)內(nèi)含子252位為G時(shí)，常常伴隨著第3外顯子區(qū)域內(nèi)804位點(diǎn)處突變?yōu)锳，導(dǎo)致密碼子26編碼的氨基酸由蘇氨酸變?yōu)樘於彼幔?dāng)一個(gè)內(nèi)含子252位為A時(shí)，第3外顯子區(qū)域內(nèi)804位點(diǎn)處常替換為C，導(dǎo)致密碼子26編碼的氨基酸為蘇氨酸[9,16]。

綜上所述，TNF-β A252G、C804A基因多態(tài)性與LAA腦梗死發(fā)生有關(guān)，TNF-β A252G基因型為GG型、等位基因?yàn)镚型，TNF-β C804A基因型為AA型、等位基因?yàn)锳型可能是LAA腦梗死的易感基因，有望成為腦梗死高危人群篩選的標(biāo)志物及干預(yù)靶點(diǎn)，但仍需擴(kuò)大樣本量、檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行更為精細(xì)化驗(yàn)證。