達格列凈聯合百令膠囊對糖尿病腎病患者尿蛋白及外周血NLRP3炎癥小體表達的影響

黨 倩，朱詠梅

長安醫院：1.內分泌科；2.腎病科，陜西西安 710016

糖尿病腎病(DN)是2型糖尿病主要并發癥，是成人慢性腎功能不全的主要因素，發病率呈逐年上升趨勢[1]。目前，DN具體發病機制尚未明確，臨床也仍缺乏治療DN的特效藥，因此，尋找新的藥物仍是臨床研究熱點。達格列凈是一種新型降糖藥物，屬于鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2(SGLT2)抑制劑，能夠降低血糖、血脂、延緩DN進展[2]。百令膠囊是由冬蟲夏草菌精制而成的發酵蟲草菌，含有多種維生素及微量元素，研究顯示，其具有保護腎臟的作用[3]。因此，本研究采用達格列凈聯合百令膠囊治療DN，并與達格列凈治療進行比較，評估兩組患者治療前后蛋白尿及外周血核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體水平變化，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年4月至2021年4月本院收治的DN患者85例為研究對象，納入標準：(1)患者均符合文獻[4]及文獻[5]中DN的診斷標準；(2)年齡>18歲；(3)患者及家屬知情同意，配合此研究。排除標準：(1)存在免疫性疾病或免疫缺陷患者；(2)高血壓腎病、其他原因引起的原發或繼發性腎病患者；(3)惡性腫瘤患者；(4)腎小球濾過率小于60 mL/(min·1.73 m2)患者；(5)既往采用達格列凈或百令膠囊治療者；(6)對研究藥物過敏者；(7)患者及家屬依從性差，不能按期完成治療及數據采集者。將85例DN患者隨機分為達格列凈組、聯合治療組。達格列凈組43例，其中男23例，女20例；年齡41～79歲，平均(64.85±9.10)歲；糖尿病病程3～6年，平均(4.75±0.92)年。聯合治療組42例，其中男24例，女18例；年齡41～80歲，平均(64.11±9.03)歲；糖尿病病程3～6年，平均(4.60±0.76)年。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院醫學倫理委員會審批并通過。

1.2方法

1.2.1治療方法 達格列凈組患者于每晚睡前皮下注射初始劑量為0.2 U/kg的甘精胰島素(珠海聯邦制藥股份有限公司，國藥準字S20160010)，根據血糖水平每3～4天調整一次劑量(每次增加2～4 U)，至血糖達標；若治療中血糖小于5.0 mmol/L，則減少甘精胰島素用量(每次減少2～4 U)，并口服0.5克/次(每天3次)的鹽酸二甲雙胍(山東壽光富康制藥有限公司，國藥準字H20066996)，在常規降糖治療基礎上，口服每次10 mg(每天1次)達格列凈(美國Astra Zeneca Pharmaceuticals LP公司，國藥準字J20170040，規格：每片10 mg)。聯合治療組在達格列凈組治療基礎上加服百令膠囊(杭州中美華東制藥有限公司，國藥準字Z10910036，規格：每粒0.2 g)進行治療，5粒/次，每天3次。兩組患者均連續治療3個月。

1.2.2血清白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平、血肌酐、24 h尿蛋白的檢測 采集患者治療前、后空腹肘靜脈血5 mL，離心10 min(3 000 r/min，離心半徑8 cm)，取上清液，凍存于-80 ℃冰箱待測。嚴格按照酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明書測定血清IL-1β、TNF-α水平。以上試劑盒均購自上海廣銳生物科技有限公司。采用Selectra E型全自動生化分析儀(上海玉研科學儀器有限公司)測定血清中血肌酐水平及24 h尿液中尿蛋白水平。

1.2.3外周血單核細胞中NLRP3炎癥小體、半胱天冬酶-1(Caspase-1) mRNA水平的檢測 采集兩組患者靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，以等量磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后，緩慢加到1∶1體積的外周血淋巴細胞分離液(上海吉至生化科技有限公司)中，并按照外周血淋巴細胞分離液說明書提取單核細胞，測定單核細胞內總RNA水平，以RNA為模板行逆轉錄，所得cDNA行qRT-PCR(其中逆轉錄試劑盒、Trizol Reagent核酸分離試劑均購自北京百奧萊博科技有限公司)。體系20 μL：2×ULtraSYBR mixture 10.0 μL，cDNA模板(25 ng/μL)2.0 μL，上下游引物各2.0 μL，ddH2O 4.0 μL；條件：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，共40個循環。NLRP3炎癥小體、Caspase-1以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt方法計算NLRP3炎癥小體、Caspase-1 mRNA相對表達水平，引物由大連寶生生物工程有限公司設計并合成，見表1。

表1 引物設計

1.3不良反應發生率的比較 統計并比較兩組患者治療期間不良反應發生情況，并計算不良反應發生率。

2 結 果

2.1兩組患者治療前后24 h尿蛋白、血肌酐水平比較 與治療前比較，治療后的達格列凈組、聯合治療組患者血肌酐、24 h尿蛋白水平均降低(P<0.05)；治療后，與達格列凈組比較，聯合治療組患者血肌酐、24 h尿蛋白水平均降低(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者治療前后血肌酐、24 h尿蛋白水平比較

2.2兩組患者治療前后血清炎癥因子水平比較 與治療前比較，治療后的達格列凈組、聯合治療組患者血清IL-1β、TNF-α水平均降低(P<0.05)；治療后，聯合治療組患者血清IL-1β、TNF-α水平均低于達格列凈組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者治療前后血清炎癥因子水平比較

2.3兩組患者治療前后外周血單核細胞中NLRP3炎癥小體、Caspase-1 mRNA水平比較 與治療前比較，治療后的達格列凈組、聯合治療組患者外周血單核細胞中NLRP3炎癥小體、Caspase-1 mRNA水平均降低(P<0.05)；治療后，與達格列凈組比較，聯合治療組患者外周血單核細胞中NLRP3炎癥小體、Caspase-1 mRNA水平均降低(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患者治療前后外周血單核細胞中NLRP3炎癥小體、Caspase-1 mRNA水平比較

2.4兩組患者治療期間不良反應發生率比較 治療期間，達格列凈組不良反應發生率為4.65%(2/43)，聯合治療組不良反應發生率為4.76%(2/42)，兩組不良反應發生率差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 兩組患者治療期間不良反應發生情況比較(n)

3 討 論

隨著我國經濟水平的不斷提升及人們飲食習慣的不斷改善，我國2型糖尿病發病率呈逐年上升趨勢。DN是2型糖尿病患者常見且嚴重的慢性血管并發癥，是導致終末期腎病發生發展的主要原因。據報道，我國住院的糖尿病患者DN發病率約為33.6%[6]。研究顯示，DN與腎小球硬化的發生等有關，臨床早期篩查以尿微量清蛋白或尿蛋白作為診斷2型糖尿病腎損傷的指標，患者一旦出現清蛋白尿，增加了治療難度，且極易進展為終末期腎衰竭[7]，目前仍無特效治療方法，因此提高DN防治水平，給予有效治療仍是臨床研究熱點和難點。

血肌酐是人體肌肉代謝產物，其水平變化主要由腎小球的濾過能力即腎小球濾過率來決定，濾過能力下降，則肌酐水平升高，表明腎臟受損，能較準確反映腎實質受損的情況[8]。腎功能損傷主要表現為分泌大量尿蛋白，其中24 h尿蛋白是反映腎功能情況的有效指標[9-10]。NLRP3是一種多蛋白復合物，糖尿病狀態下表達上調，NLRP3炎癥小體可剪切Caspase-1促使Caspase-1活化，活化的Caspase-1進一步活化下游蛋白(GSDMD)，使GSDMD的活性N端在腎小管細胞膜上聚合形成細胞膜微孔，發生細胞凋亡，進而釋放大量炎癥因子如IL-1β、TNF-α等，導致腎臟發生損傷[11-12]。本研究結果顯示，與治療前比較，治療后的達格列凈組、聯合治療組患者血肌酐、24 h尿蛋白、血清IL-1β、TNF-α及外周血單核細胞中NLRP3炎癥小體、Caspase-1 mRNA水平均降低，且聯合治療組患者血肌酐、24 h尿蛋白、血清IL-1β、TNF-α及外周血單核細胞中NLRP3炎癥小體、Caspase-1 mRNA水平均低于達格列凈組(P<0.05)。另外治療期間，兩組患者不良反應發生率差異無統計學意義(P>0.05)。說明達格列凈聯合百令膠囊能夠有效調控DN患者外周血單核細胞中NLRP3炎癥小體、Caspase-1水平進而降低炎癥反應，從而改善DN患者腎功能，且安全可靠。

達格列凈是首個獲得批準的SGLT2抑制劑，能夠增強腎臟的葡萄糖清除作用，從而降低血糖[13]。袁小利等[14]研究顯示，達格列凈能顯著降低DN患者尿蛋白水平，對DN的治療發揮一定作用。吳光秀等[15]研究顯示，達格列凈可減少DN患者尿蛋白水平及外周血NLRP3炎癥小體表達，進而抑制炎癥反應，保護腎功能。百令膠囊是由冬蟲夏草菌粉制成的膠囊，主要成分有腺苷、各種氨基酸、甘露醇、麥角醇及多種維生素，其中腺苷能夠清除氧自由基，降低脂質過氧化，使腎臟免受損傷；多種維生素及微量元素能夠補充DN患者所需的糖、蛋白質、脂肪等物質；多種氨基酸能夠直接參與機體代謝，促進氮平衡，進而促進組織細胞損傷修復，改善免疫功能[16-17]。方草等[18]研究顯示，百令膠囊對老年DN患者血糖水平及腎功能有一定調控及改善作用。庾更緒等[19]研究顯示，達格列凈聯合百令膠囊治療DN可降低患者血清中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白及單核細胞中趨化蛋白1水平，進而保護腎臟，與本研究結果相似。

綜上所述，達格列凈聯合百令膠囊治療DN可降低患者尿蛋白及外周血單核巨噬細胞中NLRP3炎癥小體、Caspase-1水平進而抑制炎癥反應進展，改善腎功能，值得臨床推廣使用。