牛乳中慶大霉素的殘留及檢測

張 波，馬 婭，張欣鈺

（1.蘭州石化職業技術學院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省中醫藥大學 定西校區，甘肅定西 743000）

1 牛乳中慶大霉素的殘留

抗生素在預防及治療奶牛疾病中發揮著重要的作用，當人體長期食用含有抗生素的牛奶會應危害人體建康，因此，1979年世界衛生組織（WHO）明確提出牛奶中不應檢出抗生素。牛奶中應檢測的抗生素種類如表1所示。

表1 牛奶中應檢測的抗生素種類

慶大霉素（Gentamicin）屬于氨基糖苷類抗生素，是靜止期殺菌藥，抗菌活性強且高，因價廉易得而廣泛應用于禽畜疾病的預防和治療。慶大霉素抗菌活性作用機理：依靠離子吸附在菌體表面，造成膜的損傷，與細菌核糖體30S小亞基不可逆結合，抑制mRNA的轉錄和病原菌蛋白質的合成，從而消滅病菌，可以治療需氧革蘭氏陰性細菌所致的感染，但其有比較嚴重的耳毒性和腎毒性。奶牛在養殖過程中使用過量的慶大霉素會在體內殘留、積聚，影響所獲乳品的質量，人們長期食用會誘導產生耐藥性，嚴重甚至會引發毒性作用。耳毒性的主要表現是：眩暈、平衡失調、聽力減退、耳鳴甚至耳聾。腎毒性癥狀可為蛋白尿、腎功能減退嚴重時可出現腎衰竭和尿毒癥[1]。為了保證人體的安全，中國農業農村部在《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中，規定了牛奶中慶大霉素的最高殘留標準為 200μg/kg。

2 慶大霉素殘留的檢測方法

2.1 理化分析法

理化分析方法基于慶大霉素的理化性質來分離和檢測，檢測部分多采用紫外分析、熒光分析、質譜等方法，而分離部分多采用色譜分離技術和電泳分離技術。理化分析方法因其檢測靈敏度高、分離效果好，所獲得的結果穩定，重復性高、準確可靠而得到了廣泛應用。慶大霉素因為具有良好的水溶性，大的分子量及極性等特征，適合使用液相色譜進行分析，而采用氣相色譜進行分析的報道極為少見。

Kowalczuk D 等建立了一種慶大霉素簡單靈敏的檢測方法，該方法基于鄰苯二醛（OPA）與N-乙酰半胱氨酸（NAC）在堿性培養基中的結合反應。用NAC代替液體硫醇形成異吲哚衍生物，避免了形成的硫醇化合物令人不快的氣味。該測定方法所獲得的標準曲線的線性范圍為 0.4～12.8μg/mL（r=0.9997），該方法的精密度在1.5～8.5。平均回收率可達100.02%[2]。

Kabra 等建立了一種簡便、準確、特異的液相色譜法測定50μL血清中慶大霉素的方法。慶大霉素在70℃反應30min，轉化為其三硝基苯衍生物。用氯仿從粗混合物中提取衍生物，用流動相沖洗反相辛基柱將慶大霉素分離為三種主要異構體。洗脫后的化合物在340nm處檢測，并根據峰高或峰面積進行定量，色譜分析在11min內完成。慶大霉素的檢出下限小于0.5mg/L，分析回收率為96.6%～99.3%，線性范圍為15.0mg/L，精密度為2.2%～2.9%[3]。

高效液相色譜法（HPLC）又稱“高壓液相色譜”，指利用高壓輸送系統，通過液體流動相將樣品泵入色譜柱，不同抗生素在柱內高效分離，進入檢測器進行檢測，完成分析。高燕霞等[4]用高效液相色譜-蒸發光散射檢測（HPLC-ELSD）法，以三氟乙酸-甲醇為流動相使硫酸慶大霉素在Apollo C18柱中得到了有效分離。依據ELSD原理，樣品濃度與檢測器對數響應呈線性關系，以此來測定硫酸小諾霉素、硫酸西索米星的濃度，該方法準確性好，靈敏度高。

色譜-質譜聯用法是牛乳中抗生素分離和檢測的一種重要的分析方法。色譜法最大的優勢在于分離效率高，為混合物的檢測提供了有力的保證。質譜法能幫助分析人員進行雜質分析，樣品分析用量少，分析時間短，結果可靠準確。但是樣品預處理復雜，為了能夠最大限度地發揮每種分析方法的優勢，常將兩種方法聯用，聯用技術有：薄層液相色譜-質譜（TLCMS）、液相色譜-質譜聯用（LC-MS）、毛細管區域電泳-質譜聯用（GIE-MS）等。劉雪紅等報道了一種采用超高效液相色譜-串聯質譜分析方法，準確、簡單、快速地檢測了牛奶中的7種氨基糖苷類抗生素（鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、安普霉素、大觀霉素）。分析過程采用乙酸銨緩沖溶液提取樣品，分離色譜柱為CORTECS HILIC，流動相采用甲酸銨溶液洗脫。采用該方法所獲的標準曲線范圍為0.1～5μg/m L（r＞0.996），平均回收率可達80%～117.5%，檢測限為10μg/kg，相對標準偏差均小于15%[5]。

2.2 微生物法

微生物檢測法是牛乳中抗生素檢測的一種傳統方法，能夠比較直觀地反映抗生素的抗菌活性，使用的檢測儀器簡單，檢測價格低廉，檢測速度快，檢測靈敏度高，廣泛應用于食品、醫藥等行業。微生物檢測的原理是：抗生素會對微生物的代謝產生抑制作用，以此來定性、定量確定牛乳中放熱抗生素。如氯化三苯基四氮唑試驗法（TTC法）、紙片法（PD法）和試劑盒法等。

TTC法的檢測原理是在牛乳中生長的嗜熱鏈球菌會將無色TTC溶液還原為紅色的三苯甲臜，而牛乳中有抗生素存在會抑制嗜熱鏈球菌的生長，TTC不會被還原溶液呈無色。TTC法應用廣泛價格便宜。黃怡君等[6]使用TTC法對牛乳中的抗生素（青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等9種）進行了檢測，檢測的靈敏性均達到了農業農村部對抗生素殘留最高限量的要求。

王志強等報道了一種牛奶中多種抗生素殘留的快速檢驗方法。該方法基于抗生素對細菌的抑制作用，快速檢測牛奶中10種殘留抗生素。該方法氨芐青霉素、青霉素最低檢出限為0.001μg/mL，金霉素、土霉素、紅霉素、四環素最低檢出限為0.01μg/mL，鏈霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素最低檢出限為0.1μg/mL，該方法最低檢出限結果優于GB/T 4789.27—2003TTC法。采用本方法成本低、靈敏度高、穩定性好，檢測時間短，能同時測定10種抗生素[7]。

紙片法，目前主要使用的是：枯草桿菌法、嗜熱脂肪桿菌法。枯草桿菌法只能檢測β內酰胺類抗生素，而嗜熱鏈球菌法可以檢測除了β內酰胺類抗生素的多種抗生素。檢測原理為浸有牛奶的濾紙片貼在含有枯草桿菌或嗜熱脂肪桿菌的培養基中培養。若牛奶中含有抗生素會抑制菌種的生長，紙片周圍會出現抑菌圈。若牛奶中不含有抗生素，菌種正常地生長，紙片周圍有不透明的菌層[8]。

Qin Wu等建立了一種微生物抑制法，用于牛奶中抗生素的快速篩選。該方法樣品預處理簡便，以嗜熱地芽孢桿菌 ATCC12980 作為指示菌，該試劑盒對牛奶中34種常見抗生素殘留的檢出限均低于或接近歐盟和中國規定的最大殘留限量，包括β-內酰胺類（13）、氨基糖苷類（6）、四環素類（4）、磺胺類（6）、大環內酯類（4）、林可酰胺類（1）。檢測的假陽性率為1%，假陰性小于5%。該試劑盒在4℃條件下，保質期超過6個月。此外，試劑盒檢測結果與采用超高效液相色譜-質譜串聯法結果保持一致，該試劑盒可用于牛乳中的抗生素篩查。該試劑盒具有靈敏度、特異性高、重現性、穩定性、可靠性高、操作簡單、成本低、通量大等優點，具有廣闊的應用前景。[9]

2.3 免疫分析法

免疫測定法基于抗原、半抗原同抗體特異性結合，檢測靈敏度高，特異性強，測定成本低，廣泛引用于醫藥、環境監測等領域。免疫分析法和其他方法的聯用也是牛乳中慶大霉素檢測技術發展的重要方向之一。

Yeluri T 等描述了基于 cyclamn-Au NPs的敏感比色法檢測新霉素和慶大霉素的進展。利用紫外-可見光譜、傅里葉變換紅外光譜、透射電子顯微鏡、動態光散射和zeta電位等方法對cyclamn-Au NPs進行了表征。在新霉素和慶大霉素存在下cyclamn-Au NPs會聚集，導致顏色從紫色變為藍色，530nm處的特征吸收峰被紅移到一個更長的波長（660nm）。采用紫外-可見吸收法測定了新霉素和慶大霉素的檢出限，分別為 1.87 × 10-8mol/L 和 2.35 × 10-8mol/L[10]。

R.M Van Es等為了開發一種簡單、快速的基于現場方法將牛奶中的慶大霉素量化到監管范圍中，已經評估了許多方法，包括免疫分析與流動注射分析和電化學檢測相結合。抗慶大霉素抗體被吸附在硝酸纖維素和聚碳酸酯固相載體上，并放置在與流動池安裝的電極接觸或電極-電池組件的上游。在競爭性免疫測定之后，根據電化學測量的葡萄糖氧化酶標記活性的程度對分析物水平進行量化。完全組裝的流動池裝置（原位方法）能夠在10min內檢測牛奶中 0到 100μg/kg的慶大霉素，變異系數值為 13.2%，并且沒有樣品預處理。在細胞組裝和信號測量之前，流通池外需要孵育90min和高達 38.7% 的 CV 值。原位測定操作簡單、可自動化，并且通過使用廉價、可大量生產的絲網印刷電極，適合開發一次性使用測量盒[11]。

王永智等[12]基于免疫分析法抗原和抗體的高特異性，結合表面等離子共振（SPR）技術將慶大霉素-BSA-GM偶聯到S系列CM5芯片上，利用競爭抑制性準確高效地檢測了牛乳中的慶大霉素。該方法檢測準確度高，平均回收率為102.60%，RSD為9.58。采用該檢測方法結果的重復性好，牛乳中慶大霉素濃度為3.2、12.8、51.2ng/mL時，計算所得的 RSD 結果分別為4.56%、4.83%、3.84%。本實驗測得的中間精密度高，選擇實驗員A和B獨立操作，檢測六次，計算所得RSD為4.65%。慶大霉素在 0.8～102.4ng/mL的濃度范圍內，儀器響應單位（Ru）和慶大霉素的濃度（ng/mL）有良好的線性回歸關系（R2=0.997 7）。

3 結束語

牛乳中抗生素殘留的常用的三種檢測方法：理化分析法、微生物法及免疫分析法。理化檢測法檢測速度快、靈敏性高、特異性好、重復性強，但是儀器價格昂貴、樣品的前處理過程復雜、程序復雜，常用于技術部門。微生物法操作簡單、價格低廉但是微生物的培養時間較長，與檢測人員的操作水平關系密切，在企業中使用較為廣泛。免疫分析法靈敏度高，特異性強，樣品處理量大，檢測時間短，但是方法建立難度大，使用范圍逐漸擴大。