lncRNA MALAT1通過miR-124-3p/SOX7分子軸促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移和血管生成

陳前波，席曉婷，馬 嘉，趙劍峰，王雪維，蔡 斌，程 泉，李俊嫻，李 燕

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]。DR在糖尿病患者中的發(fā)病率超過50%。視網(wǎng)膜血管基底膜增厚、血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖形成新的血管是DR的主要病理特征[2]。其中，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞惡性生物學(xué)行為加強(qiáng)，引起的微血管功能障礙，或最終導(dǎo)致新生血管形成是危害視網(wǎng)膜功能的主要原因之一[3]。因此，尋找DR患者中與視網(wǎng)膜微血管功能障礙相關(guān)的分子并探究其作用機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的靶標(biāo)用于診斷或緩解患者微血管功能障礙。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1是在人類多種惡性腫瘤中的一種高表達(dá)且具有促癌作用的lncRNA。其表達(dá)水平可作為腫瘤發(fā)生發(fā)展、診斷及預(yù)后的標(biāo)志[4]。lncRNA MALAT1在體內(nèi)和體外能顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力[5]。最近研究表明，lncRNA MALAT1與DR的發(fā)展相關(guān)[6]。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)參與或調(diào)控疾病的進(jìn)展已被大量研究證實(shí)。并且異常表達(dá)的miRNA也被建議作為DR診斷生物標(biāo)志物[7]。其中，miR-124-3p在DR患者血漿中的表達(dá)水平顯著降低[8-9]。并且，有研究表明，體外視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成過程中miR-124-3p的表達(dá)顯著下調(diào)[10]。SOX7(Sex-determining region Y-box 7)在調(diào)控心血管系統(tǒng)的發(fā)育、內(nèi)皮細(xì)胞向造血細(xì)胞轉(zhuǎn)化、動靜脈分化等進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[11-12]。研究表明，SOX7參與促進(jìn)和維持視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)形成[13]。Starbase網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果表明，SOX7是miR-124-3p的一個靶基因。為此，本研究將探討lncRNA MALAT1通過miR-124-3p/SOX7分子軸調(diào)控視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管形成的分子機(jī)制。深化了解DR患者視網(wǎng)膜新生血管的形成，為發(fā)展新的分子標(biāo)記用于診斷或緩解DR患者微血管功能障礙提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料細(xì)胞株與主要試劑：人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞hRMECs(貨號：BNCC340362)購自北納生物昆明細(xì)胞庫。DMEM、胎牛血清、胰酶購自Hyclone；青霉素、鏈霉素購自阿拉丁試劑；Lipofectamine 2000、Trizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen；qPCR定量試劑盒購自Takara；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL顯色試劑盒、CCK8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；Transwell小室購自Corning；質(zhì)粒提取試劑盒、雙熒光素報告基因試劑盒購自Promega；鈣黃綠素染色試劑盒購自上海生工；Western blotting一抗(Antibody-SOX7、Antibody-GADPH)和二抗(羊抗兔)購自Abcam；Matrigel膠購自BD；MALAT1、miR-124-3p、U6的引物，miR-124-3p mimic/inhibitor/scramble以及敲低和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中用到的sh-lncRNA MALAT1、SOX7過表達(dá)載體由上海生工代為合成或構(gòu)建。

1.2方法

1.2.1樣本采集收集2016-06/2018-12在云南省第一人民醫(yī)院就診的糖尿病患者(糖尿病組，30例)、糖尿病視網(wǎng)膜病變患者(糖尿病視網(wǎng)膜病變組，30例)以及健康志愿者(正常組，30例)空腹?fàn)顟B(tài)下早晨6∶00～8∶00時間段的靜脈血清樣本。入選標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會眼底病組通過的DR臨床診療指南(2014年)[14]，糖尿病患者和糖尿病視網(wǎng)膜病變患者：血糖>10.0mmol/L；正常志愿者對照血清標(biāo)本：血糖<7.0mmol/L。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均知情同意。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組及轉(zhuǎn)染hRMECs細(xì)胞用10%胎牛血清、100μg/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。檢測葡萄糖處理對lncRNA MALAT1表達(dá)水平的影響實(shí)驗(yàn)中，將hRMECs細(xì)胞分為4組培養(yǎng)96h：陰性對照組(NC組)，正常對照組(Control組，5mmol/L D-葡萄糖)、葡萄糖組1(15mmol/L D-葡萄糖)、葡萄糖組2(25mmol/L D-葡萄糖)、葡萄糖組3(35mmol/L D-葡萄糖)。機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)進(jìn)行以下分組：正常對照組(5mmol/L)(Ⅰ組)；葡萄糖組(25mmol/L)(Ⅱ組)；葡萄糖+過表達(dá)miR-124-3p組(Ⅲ組)；葡萄糖+過表達(dá)lncRNA MALAT1+過表達(dá)miR-124-3p組(Ⅳ組)；葡萄糖+過表達(dá)miR-124-3p+過表達(dá)SOX7組(Ⅴ組)；葡萄糖+敲低lncRNA MALAT1+過表達(dá)SOX7組(Ⅵ組)。

選擇生長狀況良好的對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，0.25%的胰酶消化，調(diào)整密度為1×105cell/mL，接種到6孔板，每孔加2mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右，采用lipofectamine 2000按上述分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將sh-lncRNA MALAT1、miR-124-3p mimics、pcDNA-SOX7等分別轉(zhuǎn)染到hRMECs，并轉(zhuǎn)染相應(yīng)的陰性對照。所有實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.3qRT-PCR檢測lncRNAMALAT1和miR-124-3p的表達(dá)水平RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，DNA酶處理后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用SYBR Green Master Mix反應(yīng)體系進(jìn)行q-PCR檢測。U6作內(nèi)參，檢測各組細(xì)胞lncRNA MALAT1、miR-124-3p相對表達(dá)。反應(yīng)體系總量20μL。cDNA產(chǎn)物2μL、上下游引物各0.5μL(10μmol/L)、SYBR Green Mix 10μL。反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共40個循環(huán)。測定每個樣本的Ct值，循環(huán)數(shù)法(2-ΔΔCt)定量相對表達(dá)量。每組樣本或細(xì)胞檢測3次，取平均值。

1.2.4Westernblotting檢測SOX7表達(dá)離心收集細(xì)胞，蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，每孔50μg上樣，10% SDS-PAGE凝膠分離1h，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的PBS緩沖液封閉1h，加入SOX7一抗(1∶1000)，4℃過夜，PBST緩沖液漂洗3次，每次5min，加入SOX7二抗(羊抗兔)，37℃孵育4h。PBST緩沖液漂洗3次，β-Actin作內(nèi)參，顯色，成像，Image J分析目的蛋白的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5CCK-8法檢測hRMECs增殖活力胰酶消化對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，96孔板接種細(xì)胞，接種量5×104個/孔，每孔加100μL培養(yǎng)基，在48h后，更換新鮮培養(yǎng)基。檢測前每孔加入20μL CCK-8試劑，1h后，用酶標(biāo)儀測定450nm波長處的吸光值(D450nm)；每組3個復(fù)孔，每孔在相同條件下檢測3次。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測hRMECs遷移能力將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對照組細(xì)胞用胰酶處理，用1% FBS的完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至密度1×105cell/mL，接種于Transwell小室24孔板，上室加200μL細(xì)胞懸液，下室加500μL含10% FBS的培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)48h，取出小室，用棉簽除去微孔膜上室的細(xì)胞，PBS上下沖洗2遍，微孔膜下細(xì)胞用5%的多聚甲醛固定15min，0.5%結(jié)晶紫溶液染色15min，顯微鏡下隨機(jī)選取10個視野(100×)，對細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.7體外培養(yǎng)成管試驗(yàn)檢測hRMECs血管形成能力取96孔培養(yǎng)板每孔加入50μL Matrigel膠(1∶2與預(yù)冷2%血清DMEM稀釋)，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)30min使其凝固，將各組視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于包被Matrigel的96孔板(接種細(xì)胞數(shù)為1×105)，置于5% CO2、37℃箱內(nèi)孵育；48h后，吸去培養(yǎng)基，并用PBS清洗2遍；每孔1mL加入2μmol/L鈣黃綠素的HBSS溶液，在37℃孵育1h；用PBS緩沖液洗2遍；熒光顯微鏡觀察管狀結(jié)構(gòu)的形成情況并拍照；Image J計算形成管狀結(jié)構(gòu)的面積(成管率=管狀結(jié)構(gòu)的面積/培養(yǎng)孔面積×100%)。其中，每組細(xì)胞接種3個復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.2.8雙熒光素酶報告基因驗(yàn)證miR-124-3p與lncRNAMALAT1和SOX7的靶向作用關(guān)系StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果表明，lncRNA MALAT1與miR-124-3p、miR-124-3p與SOX7之間可能存在直接靶向作用關(guān)系。將lncRNA MALAT1、SOX7與miR-124-3p的可能靶序列及其突變體片段插入Firefly熒光素酶報告基因下游，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。將miR-124-3p mimics與pmirGLO-lncRNA MALAT1-WT/MUT或pmirGLO-SOX7-WT/MUT共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞。對照組用miR-124-3p scramble與pmirGLO-lncRNA MALAT1-WT/MUT或pmirGLO-SOX7-WT/MUT共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)完成后，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h，測熒光強(qiáng)度。每個轉(zhuǎn)染組重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，以3次熒光強(qiáng)度的平均值作為每組的結(jié)果數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1lncRNAMALAT1在DR患者血清中高表達(dá)可能與高血糖相關(guān)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組患者相比，糖尿病組患者血清lncRNA MALAT1的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.48,P<0.001)。與糖尿病組患者相比，糖尿病視網(wǎng)膜病變組患者血清中l(wèi)ncRNA MALAT1的表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.33，P<0.001)，見表1。由此推測，lncRNA MALAT1表達(dá)水平上調(diào)可能與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生相關(guān)。

表1 qRT-PCR檢測lncRNA MALAT1的表達(dá)水平

2.2葡萄糖對hRMECs增殖及遷移和血管生成的影響體外培養(yǎng)hRMECs細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，正常對照組(5mmol/L)lncRNA MALAT1的表達(dá)水平無顯著差異(t=0.41，P=0.704)。與正常對照組(5mmol/L)相比，葡萄糖組1(15mmol/L)、葡萄糖組2(25mmol/L)和葡萄糖組3(35mmol/L)lncRNA MALAT1的表達(dá)水平呈濃度依賴性上升(t=6.10、18.57、18.52，均P<0.001)。由此進(jìn)一步表明，lncRNA MALAT1表達(dá)上調(diào)可能與高血糖相關(guān)。CCK-8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，正常對照組(5mmol/L)hRMECs增殖活力無顯著差異(t=0.13，P=0.905)。與正常對照組(5mmol/L)相比，葡萄糖組1(15mmol/L)hRMECs增殖活力無顯著差異(t=2.723，P=0.053)，而葡萄糖組2(25mmol/L)和葡萄糖組3(35mmol/L)hRMECs增殖活力顯著升高(t=2.83、2.98，均P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對照組相比，正常對照組(5mmol/L)hRMECs遷移能力無顯著差異(t=0.59，P=0.588)。與正常對照組(5mmol/L)相比，葡萄糖組1(15mmol/L)、葡萄糖組2(25mmol/L)和葡萄糖組3(35mmol/L)hRMECs遷移能力均顯著提高(t=12.85、25.24、25.92，均P<0.001)。此外，體外成管能力結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，正常對照組(5mmol/L)管形成能力無顯著差異(t=0.49，P=0.652)。與正常對照組(5mmol/L)相比，葡萄糖組1(15mmol/L)、葡萄糖組2(25mmol/L)和葡萄糖組3(35mmol/L)對hRMECs成管能力顯著提升(t=10.06、20.83、21.37，均P<0.001)。且葡萄糖組2(25mmol/L)和葡萄糖組3(35mmol/L)在對hRMECs增殖活力、遷移和管形成無顯著差異(t=1.085、0.61、0.61，P=0.339、0.573、0.573)，見圖1，表2，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)葡萄糖組濃度采用25mmol/L進(jìn)行。由此可見，高濃度葡萄糖可在一定程度上促進(jìn)hRMECs的增殖、遷移和血管生成。

圖1 葡萄糖顯著促進(jìn)hRMECs遷移和成管能力 A：Transwell檢測細(xì)胞遷移；B：血管形成實(shí)驗(yàn)檢測成管能力。

表2 葡萄糖顯著促進(jìn)lncRNA MALAT1 mRNA表達(dá)及hRMECs增殖、遷移和血管生成

2.3敲低lncRNAMALAT1顯著抑制hRMECs增殖及遷移和成管能力qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與正常對照組(5mmol/L)相比，葡萄糖組2(25mmol/L)lncRNA MALAT1的表達(dá)水平顯著升高(t=11.02，P<0.001)。與葡萄糖組2(25mmol/L)相比，敲低lncRNA MALAT1后則顯著降低(t=13.97，P<0.001)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對照組(5mmol/L)組相比，葡萄糖組2(25mmol/L)hRMECs的細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)(t=3.53，P=0.024)。與葡萄糖組2(25mmol/L)相比，敲低lncRNA MALAT1減弱了葡萄糖對hRMECs增殖活力的促進(jìn)作用(t=5.02，P=0.0074)。Transwell和體外成管培養(yǎng)檢測結(jié)果分別表明，與正常對照組(5mmol/L)相比，葡萄糖組2(25mmol/L)hRMECs的遷移能力顯著增強(qiáng)、成管率顯著上升(t=29.43、23.88，均P<0.001)。與葡萄糖組2(25mmol/L)相比，敲低lncRNA MALAT1后則逆轉(zhuǎn)了這一過程(t=18.37、19.60，均P<0.001)，見圖2，表3。由此可見，敲低lncRNA MALAT1可顯著抑制葡萄糖對hRMECs增殖、遷移和血管生成能力的促進(jìn)作用。

表3 敲低lncRNA MALAT1顯著抑制hRMECs增殖、遷移和成管能力

圖2 敲低lncRNA MALAT1顯著抑制hRMECs遷移和成管能力 A：Transwell檢測細(xì)胞遷移；B：血管形成實(shí)驗(yàn)檢測成管能力。

2.4miR-124-3p與lncRNAMALAT1和SOX7的靶向作用關(guān)系StarBase網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示，lncRNA MALAT1與miR-124-3p、miR-124-3p與SOX7可能存在靶向結(jié)合關(guān)系(圖3A)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，miR-124-3p mimics與pmirGLO-lncRNA MALAT1-WT、pmirGLO-SOX7-WT共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組，熒光素酶活性顯著低于miR-NC(miR-124-3p陰性對照)組(1±0.024vs0.39±0.042，1±0.082vs0.45±0.017，t=17.68、9.27，均P<0.001，圖3B、C)，而miR-124a-3p mimics與pmirGLO-IncRNA MALAT1-MUT、pmirGLO-SOX7-MUT共轉(zhuǎn)染組，熒光素酶活性與miR-NC組相比無顯著差異(1.01±0.065vs1.00±0.041，1.05±0.029vs1.04±0.031，t=0.12、0.11，P=0.909、0.916，圖3B、C)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與sh-NC(sh-lncRNA MALAT1)組相比,sh-lncRNA MALAT1組miR-124-3p基因表達(dá)水平顯著升高(0.99±0.034vs6.92±0.509，t=16.44，P<0.001，圖3D)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-124-3p mimic組SOX7蛋白表達(dá)水平顯著性降低(1.26±0.072vs0.73±0.37，t=9.27，P<0.001，圖3E)。總之,本研究結(jié)果表明,lncRNA MALAT1負(fù)調(diào)控miR-124-3p, miR-124-3p負(fù)調(diào)控SOX7。

圖3 miR-124-3p與lncRNA MALAT1和SOX7的靶向作用關(guān)系 A：StarBase網(wǎng)站預(yù)測lncRNA MALAT1與miR-124-3p、miR-124-3p與SOX7靶向結(jié)合關(guān)系；B：雙熒光素酶報告基因檢測證明lncRNA MALAT1和miR-124-3p靶向結(jié)合；C：雙熒光素酶報告基因檢測證明miR-124-3p和SOX7靶向結(jié)合；D：qRT-PCR檢測miR-124-3p的表達(dá)水平；E：Western blot檢測SOX7蛋白表達(dá)水平。bP<0.01 vs miR-NC組；dP<0.01 vs sh-NC組。

2.5lncRNAMALAT1通過miR-124-3p/SOX7分子軸促進(jìn)hRMECs增殖及遷移和體外成管能力與Ⅰ組相比，Ⅱ組miR-124-3p表達(dá)顯著下調(diào)(t=9.13，P<0.001)。與Ⅱ組相比，Ⅲ組miR-124-3p表達(dá)顯著上調(diào)(t=11.27，P<0.001)；與Ⅲ組相比，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組miR-124-3p表達(dá)顯著下調(diào)(t=9.89、8.10、8.87，均P<0.01)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅱ組細(xì)胞增殖活力顯著升高(t=3.18，P=0.033)。與Ⅱ組相比，Ⅲ組細(xì)胞增殖活力顯著下降(t=3.30，P=0.030)；與Ⅲ組相比，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組細(xì)胞增殖活力顯著升高(t=3.84、3.03、3.00，P=0.019、0.039、0.040)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅱ組細(xì)胞遷移能力顯著上升(t=45.32，P<0.001)。與Ⅱ組相比，Ⅲ組細(xì)胞遷移能力顯著降低(t=61.24，P<0.001)；與Ⅲ組相比，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組細(xì)胞遷移能力顯著提高(t=61.24、55.11、52.66，均P<0.001)。管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅱ組細(xì)胞管形成能力顯著提高(t=25.27，P<0.001)。與Ⅱ組相比，Ⅲ組細(xì)胞管形成能力顯著降低(t=28.86，P<0.001)；與Ⅲ組相比，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組細(xì)胞管形成能力顯著提高(t=28.06、20.79、27.20，均P<0.001)，見圖4，表4。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-124-3p與lncRNA MALAT1和SOX7的靶向結(jié)合序列相同，由此可知lncRNA MALAT1與SOX7競爭結(jié)合miR-124-3p，降低miR-124-3p對SOX7負(fù)調(diào)控作用，促進(jìn)hRMECs增殖、遷移和血管形成。

圖4 lncRNA MALAT1通過miR-124-3p/SOX7分子軸促進(jìn)hRMECs遷移和成管能力 A：Transwell檢測細(xì)胞遷移；B：血管形成實(shí)驗(yàn)檢測成管能力。

表4 lncRNA MALAT1通過miR-124-3p/SOX7分子軸促進(jìn)hRMECs增殖、遷移和體外成管能力

3 討論

高血糖可能是誘發(fā)DR的一個重要因素，DR患者長期的高血糖可能直接或間接促進(jìn)視網(wǎng)膜血管形成和血液-視網(wǎng)膜屏障的破壞[15]。近年研究表明lncRNA參與了DR的發(fā)生和發(fā)展，DR患者血漿中異常表達(dá)的lncRNA可能成為一種新的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)[16]。lncRNA MALAT1是一個與在眼部疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的lncRNA。lncRNA MALAT1在糖尿病性白內(nèi)障患者前晶狀體囊組織中高表達(dá)，體外葡萄糖處理顯著促進(jìn)lncRNA MALAT1在人晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)，并通過激活p38/MAPK信號通路促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞HLECs的凋亡和氧化應(yīng)激[17]。增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)中，lncRNA MALAT1在視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞中高表達(dá)，并促進(jìn)RPE細(xì)胞的增殖和遷移[18]。最近研究表明lncRNA MALAT1可作為篩查DR和NPDR早期診斷以避免進(jìn)展為PDR的無創(chuàng)生物標(biāo)志物[19]。lncRNA MALAT1在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜、高糖處理的RF/6A細(xì)胞以及糖尿病患者的體液樣本中均顯著上調(diào)[20]。體外實(shí)驗(yàn)中敲低lncRNA MALAT1顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中l(wèi)ncRNA MALAT1基因敲除降低新生小鼠視網(wǎng)膜血管生成[21]。由上述多項研究結(jié)果可知lncRNA MALAT1在DR中高表達(dá)可能促進(jìn)視網(wǎng)膜微血管的形成。miRNAs參與糖尿病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，異常表達(dá)的miRNAs可作為糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志[22-23]。DR患者中異常表達(dá)的miRNA參與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及血管生成等生物學(xué)過程的調(diào)控。Walz等通過分析視網(wǎng)膜病變患者和正常人的miRNA的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)10個異常表達(dá)的miRNA，其中，miR-124-3p在視網(wǎng)膜病變血管形成過程中表達(dá)水平顯著下調(diào)[8]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-124-3p表達(dá)下調(diào)與癌細(xì)胞的增殖、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管形成等惡性生物學(xué)行為相關(guān)[24-26]。

SOX7是SOX家族成員之一，在細(xì)胞增殖、分化、遷移，血管生成等過程中具有重要調(diào)控作用。SOX7在血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，SOX7缺失導(dǎo)致胚胎致死性和小鼠血管生成嚴(yán)重受損[27]。SOX7在調(diào)控血管形成的主要途徑，包括VEGF/Flk1信號通路、Wnt信號通路和Notch通路[12]；同時，SOX7作為VEGF信號的正反饋調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)血管生成[28]。

本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1在DR患者血漿中高表達(dá)，體外高濃度的葡萄糖培養(yǎng)顯著促進(jìn)lncRNA MALAT1在hRMECs中的表達(dá)，lncRNA MALAT1通過降低miR-124-3p對SOX7的負(fù)調(diào)控作用而促進(jìn)葡萄糖誘導(dǎo)的hRMECs增殖、遷移和血管形成。因此，在DR患者中抑制lncRNA MALAT1的水平可能有助于緩解視網(wǎng)膜微血管功能障礙。