DNA甲基化在眼科疾病中的研究進展

劉 琳，嵇霄雯，魏瑞華

0 引言

DNA甲基化是指DNA序列上特定的堿基在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化作用下，以s-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，以共價鍵結合方式獲得一個甲基基團的化學修飾過程[1-2]。異常病理條件下，DNA甲基化狀態發生改變，引起機體內環境紊亂，產生病變。DNA甲基化作為遺傳表觀學的重要研究內容之一，已被認為在形成復雜的表型中發揮重要作用，包括疾病的病因學等。這些修飾已被證明具有高度的可塑性，能夠響應環境變化，并且以遺傳的方式改變基因表達。近年來，在角、結膜等眼表疾病、青光眼、白內障以及視網膜疾病、眼部腫物等各領域，有關DNA甲基化的研究層出不窮，為不同眼部疾病發病機制的研究，提供了新的探索方向。

1 角膜疾病

異常DNA甲基化參與角膜疾病發生發展[3]，了解DNA甲基化在角膜生理病理過程中的作用至關重要。正常生理條件下角膜表達DNMT1、DNMT2、DNMT3[4]，角膜上皮傷口愈合期間，DNMT1表達上調，整體DNA甲基化水平升高，而下調DNMT1可抑制角膜上皮細胞增殖及遷移，延緩傷口愈合[5]。

Fuchs角膜內皮營養不良(Fuchs endothelial corneal dystrophy，FECD)患者存在大量差異甲基化位點[6]，其中離子通道相關基因低甲基化對角膜上皮功能至關重要，可能調控角膜上皮功能使FECD角膜透明度喪失。細胞外基質異常沉積是FECD的特異性改變，Snail和ZEB1是細胞外基質誘導基因，在FECD患者中高表達[7]，miRNA基因的啟動子作為FECD異常甲基化位點，miR-199B高甲基化下調miR-199B-5p，調控Snail和ZEB1基因的表達[8]，提示調控miRNA甲基化可引起細胞外基質沉積從而導致疾病發生發展。

2 結膜疾病

翼狀胬肉是結膜疾病中的常見病，為瞼裂部球結膜與角膜上一種贅生組織。Arish等[9]發現翼狀胬肉患者胬肉組織中鼠雙微基因2(murine double minute 2，MDM2)啟動子低甲基化，蛋白表達上調， p53蛋白表達下調。MDM2是腫瘤抑制因子p53的負調控基因[10]，DNA甲基化修飾增加與p53蛋白的結合，抑制p53轉錄調節功能[11]。此外，研究發現，翼狀胬肉組織中轉谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2，TGM-2)的轉錄起始位點及E-cadherin基因啟動子CpG島高甲基化，基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2，MMP2)的轉錄起始位點下游及CD24的轉錄起始位點上游CpG島低甲基化，提示基質(MMP2)重塑和細胞(TGM-2、CD24、E-cadherin)黏附相關基因的異常DNA甲基化與翼狀胬肉高度相關[12]。

3 青光眼

青光眼是一組以視乳頭萎縮及凹陷、視野缺損及視力下降為共同特征的疾病。研究表明青光眼患者Schlemm管內皮細胞及小梁網細胞存在全基因組甲基化水平升高，小梁網細胞促纖維化因子轉化生長因子(transforming growth factor, TGF)β1表達增加，抗纖維化基因RASAL1表達降低，DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-AC)可抑制纖維化[13-15]，提示DNA甲基化改變導致的眼組織異常纖維化可能是青光眼發病機制之一。此外，跨篩板壓差是青光眼視神經受損的主要原因，青光眼患者鞏膜篩板變薄，鞏膜篩板細胞TGFβ1啟動子甲基化水平降低[16]，纖維化水平增加，提示青光眼跨篩板壓形成可能與篩板纖維化有關。

4 白內障

白內障是由各種原因引起晶狀體代謝紊亂，從而導致晶狀體蛋白質變性而發生混濁的疾病。研究發現，晶狀體上皮細胞中DNA甲基化相關基因表達上調[17]，外周血差異甲基化基因與晶狀體上皮細胞凋亡相關通路相關[18]。晶狀體上皮細胞機能減退，無法清除自由基，導致氧化應激反應發生，細胞凋亡，造成晶狀體氧化損傷，白內障發生。

機體抗氧化基因[19-20]如沃納綜合征基因、谷胱甘肽轉移酶P1等，其啟動子在白內障患者晶狀體中高甲基化，氧化與抗氧化作用失衡，氧化應激反應發生。Nrf2/Keap1是機體抗氧化機制的重要通路，核因子E2相關因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是轉錄調節因子，可激活多種抗氧化酶；Keap1即Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1，是Nrf2的負調控蛋白。研究發現，白內障患者晶狀體的Keap1基因啟動子DNA甲基化水平降低，Nrf2活性減弱，導致氧化系統失衡，晶狀體上皮細胞氧化凋亡[21]。

5 視網膜疾病

5.1年齡相關性黃斑變性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)是一種神經退行性疾病。氧化應激和炎癥反應會降低視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium, RPE) DNMT的表達及活性，下調甲基化水平[22]，然而研究發現ARMD患者外周血DNMT表達及活性上升[23]，表明不同樣本之間DNA甲基化存在差異，可能由于模擬的氧化應激及炎癥反應不能完全替代ARMD的病理環境，或外周血在經過復雜的生物過程后甲基化修飾發生改變而表現出差異，白藜蘆醇可以抑制氧化應激及炎癥反應對細胞甲基化水平的影響。谷胱甘肽-S-轉移酶作為氧化應激反應的關鍵蛋白，其啟動子在ARMD患者RPE/脈絡膜和視網膜神經感覺層中甲基化水平上調[24]；同型半胱氨酸作為氧化應激反應的重要因子，異常堆積可顯著提高DNMT的活性，增加視網膜DNA甲基化水平[25]。ELOVL2基因與年齡相關性疾病有關，其功能受損會干擾脂質合成，增加內質網應激和線粒體功能障礙。研究發現，ELOVL2在ARMD患者中高甲基化，玻璃體腔注射甲基化抑制劑可逆轉其高甲基化狀態，恢復部分視網膜功能[26]。

5.2糖尿病視網膜病變糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是長期高血糖使毛細血管自身調節失常，活性氧自由基堆積引起氧化應激反應，導致線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)結構受損，內皮細胞屏障功能受損，最終引起的視網膜損傷[27-29]。視網膜線粒體腫脹可導致線粒體融合蛋白(mitofusin 2，Mfn2)甲基化，加劇線粒體損害及氧自由基堆積，DNA甲基化抑制劑可抑制Mfn2甲基化，改善視網膜功能[30-31]。

高血糖水平使視網膜基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP9)基因啟動子甲基化-羥甲基化過程失衡，視網膜受損[32]。同型半胱氨酸可提高視網膜DNA甲基化酶活性，激活MMP9，引起血視網膜屏障功能障礙，調節同型半胱氨酸可預防或減緩DR病變的發展[33]。SOD2基因是負責清除線粒體超氧物的基因，編碼MnSOD酶，其啟動子在DR患者中高甲基化[34]。上調SOD2表達可抑制糖尿病引起的mtDNA甲基化[35]。MnSOD酶模擬物可減少MMP9啟動子區與DNMT1結合，防止線粒體損傷[36]。高血糖狀態下，Ras相關的C3肉毒素1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)啟動子區甲基化改變，Rac1激活，胞漿活性氧水平增加，引起氧化應激[37]。DNMT抑制劑、抗氧化劑均可調節視網膜抗氧化酶DNA甲基化，維持氧化還原平衡，阻止DR進展[38-39]。

DR患者外周血全基因組DNA甲基化水平明顯上調[40-41]，較無視網膜病變的糖尿病患者，DR患者外周血甲基化程度更高[42]，故外周血特異性DNA甲基化改變可能是DR診療的生物標志物。此外，保持良好生活方式和健康體格有助于調節糖尿病患者DNA甲基化水平，預防和延緩視網膜病變[43]。

6 眼部腫瘤

6.1葡萄膜黑色素瘤葡萄膜黑色素瘤起源于葡萄膜內黑色素細胞，惡性程度較高，易經血行轉移，預后較差，了解致病機制有助于改善預后、延長存活時間。

RAS相關區域家族1A(Ras association domain family 1 A，RASSF1A)、BRCA1相關蛋白1(BRCA1 associated protein1，BAP1)及p16INK4a是常見抑癌基因，葡萄膜黑色素瘤中RASSF1A、BAP1及p16INK4a啟動子高甲基化，蛋白表達下降[44]，且研究發現啟動子的高甲基化與腫瘤轉移有關[45]。DNA甲基化轉移酶抑制劑處理可逆轉抑癌基因啟動子甲基化狀態，減少腫瘤轉移[46]。

癌基因經DNA甲基化修飾表達上調，促進腫瘤發生發展。黑色素瘤特異性抗原是黑色素瘤患者中篩查得出的表面抗原，在葡萄膜黑色素瘤患者中該基因啟動子異常低甲基化，且與轉移風險增加有關，是轉移性葡萄膜黑色素瘤免疫治療的潛在靶點[47]。生長分化因子11(growth differentiation factor 11，GDF11)調節細胞增殖、凋亡等生物過程，Yu等[48]發現在腫瘤組織中GDF11啟動子CpG位點低甲基化，蛋白表達明顯高于鄰近正常組織。

6.2視網膜母細胞瘤視網膜母細胞瘤基因(RB1)的缺失或失活是視網膜母細胞瘤(retinoblastoma, RB)發生的重要機制，RB患者中RB1基因啟動子高甲基化，蛋白表達下調，細胞分裂能力受損，細胞分化方向異常，導致疾病的發生發展[49]。其余抑癌基因如RASSF1A、MEG3、APC-2等，均受DNA甲基化調控，經去甲基化劑處理可逆轉其結果[50-51]。

7 小結

表觀遺傳學可以作為基因-環境的中介，為研究疾病發生發展機制提供新思路。目前，眼科疾病中DNA甲基化的研究還處于初步階段，隨著DNA甲基化研究技術的發展，有望明確DNA甲基化在不同眼科疾病發生發展中的機制，為眼科疾病診療提供新思路。