不同方法構建小鼠過敏性結膜炎免疫耐受模型的比較

白夢天，李 韻，胡竹林

0 引言

近年來，過敏性結膜炎的發病率逐年上升，該趨勢在經濟發達的國家和地區更為明顯[1-2]。遺傳背景的差異難以較好解釋該流行病學特點。目前的觀點認為，過敏性結膜炎發病率增高主要與工業化進展加劇、城市環境污染以及全球氣候變暖有關[3-4]。但結合日常診療實際，發現多數過敏性結膜炎患者均有較好的生活條件和潔凈舒適的工作環境，因此我們猜想，是否“過度潔凈”的環境反而增加了過敏性結膜炎的發病率。“衛生假說”指出，不潔的居住環境、較差的生活條件、家庭成員多以及經濟水平低的國家和地區過敏性哮喘、濕疹等發病率較低，這可能與更易暴露于微生物、寄生蟲以及動植物有關[5]，而在生命早期階段反復暴露于變應原(塵螨、花粉以及微生物等)可顯著降低成年后發生過敏性疾病的風險[6]。

抗原特異性治療(antigen-specific immunotherapy，AIT)正是基于“衛生假說”而提出的，是誘導免疫耐受狀態而針對過敏性疾病病因的治療方式。通過多次口服或皮下注射低劑量特異性抗原，不僅能夠抑制Th2、Th17細胞功能，還能夠誘導和活化調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)和Breg引發機體產生特異性免疫耐受，從而減輕機體過敏癥狀[7]。已有研究證實，皮下免疫療法可緩解哮喘癥狀[8]，舌下含服法可改善過敏性鼻結膜炎癥狀[9]，口服法可改善自身免疫性腦脊髓炎[10]、葡萄膜炎[11]、哮喘[12]癥狀。但該方法療程長，且不同個體對治療的效果有明顯差異，分析可能是由于患病后較難誘導免疫耐受狀態，或成年人難以誘導和維持免疫耐受狀態。

基于此，我們認為，個體的免疫耐受狀態，取決于其首次暴露于致敏原時淋巴細胞發育情況以及細胞因子的生理環境，根據該情況和環境的差異表現出不同的免疫狀態，從而避免或減輕過敏性結膜炎的發生。目前，關于過敏性結膜炎免疫耐受的研究更多的是對已經發病的個體進行免疫耐受治療，臨床上關于過敏性結膜炎的治療仍以脫離過敏原，減輕炎癥反應為主，而未過多關注生命早期的生活環境對疾病的影響。故本研究先給予新生小鼠持續抗原刺激，待其成年后以相同抗原再刺激，觀察小鼠眼部情況和全身炎癥反應有無減輕，初步探索生命早期與過敏性結膜炎的關系。以期從“衛生假說”和免疫耐受的角度更深入地認識和理解過敏性結膜炎，從而為過敏性結膜炎的預防和診治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級Balb/c新生小鼠50只，雄性23只(體質量：1周齡時4.12±1.83g；3周齡時9.83±2.03g；7周齡時19.74±2.93g；8周齡時22.43±3.02g)，雌性27只(體質量：1周齡時4.42±0.73g；3周齡時9.92±2.04g；7周齡時17.04±1.73g；8周齡時20.83±2.53g)。所有小鼠購買自昆明醫科大學實驗動物中心[SCXK(滇)K2015-0002]，實驗地點為中國醫學科學院昆明動物研究所[SYXK(滇)K2017-0008]。本實驗方案通過昆明醫科大學動物倫理委員會審核(No.kmmu 2019002)。本實驗遵從動物實驗的3R原則，在動物飼養中給予人道主義關懷。

1.1.2主要試劑和儀器豚草花粉(ragweed，short，RW)，Greer Labs公司(美國)；卵清蛋白(ovalbumin，OVA)，Sigma公司(美國)；屋塵螨(house dust mite，HDM)，Greer Labs公司(美國)；氫氧化鋁佐劑(aluminum hydroxide adjuvant)，Thermo公司(美國)；RNAiso Plus， TaKaRa公司(日本)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa公司(日本)；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ，TaKaRa公司(日本)；mice IL-17 ELISA Kit，ELK Biotechnology公司(武漢)。QuantStudio 12K flex實時熒光定量PCR系統，ABI公司(美國)；手術顯微鏡，蔡司公司(德國)。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立本課題組前期工作已完成動物模型建立的條件和方法的摸索及驗證，均達到實驗要求[13-14]。Balb/c新生乳鼠50只隨機分為空白對照組、OVA+皮下注射組、OVA+霧化吸入組、OVA+灌胃組、RW+皮下注射組、RW+霧化吸入組、RW+灌胃組、HDM+皮下注射組、HDM+霧化吸入組、HDM+灌胃組(n=5只/組)。除空白對照組外，1周齡時，各組將相應抗原(5mg/kg)溶解于10μL氫氧化鋁佐劑中，并通過相應暴露方式處理小鼠，隔日1次，直至3周齡，其中霧化吸入組小鼠在鼠籠中放置霧化裝置，并加入40mL雙蒸水，每次霧化30min；7周齡時，各組小鼠給予相應抗原(25mg/kg)腹腔注射1次；8周齡時，各組再次給予相應抗原10mg/kg溶解于氫氧化鋁佐劑10μL中滴雙眼，連續滴3d。末次滴眼20min后行眼前段照相，24h后處死小鼠(注射大劑量戊巴比妥鈉)，小心分離雙眼結膜組織并放置于1.5mL離心管中進行總RNA提取、反轉錄后，RT-qPCR法檢測結膜重組人正常T細胞表達和分泌因子(RANTES)、IL-17 mRNA表達水平；心臟采血后行ELISA檢測血清IL-17濃度變化情況。

1.2.2小鼠血清的制備腹腔注射0.2%戊巴比妥鈉徹底麻醉小鼠，全身酒精消毒，轉入無菌操作臺內，仰臥固定于手術臺上。用消毒后的剪刀沿小鼠左側3～4肋間剪開胸壁，暴露心臟。將1mL針頭刺入右心，小心吸取血液后注入1.5mL離心管中，于4℃冰箱中放置24h。3 500r/min離心15min，可見血清呈淡黃色位于離心管最上層。用移液器小心吸取血清于新的1.5mL離心管中，放置于-80℃儲存備用。

1.2.3RT-qPCR法檢測結膜組織中IL-17和RANTESmRNA表達TRIzol法進行結膜組織總RNA提取，逆轉錄為 cDNA，模板3μL， 總 體 系 為 20μL。引物序列：IL-17正向引物：5’-TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3’，反向引物：5’-CTTTCCCTCCGCATTGACAC-3’；RANTES(CCL5)正向引物：5’-TGCCTAAAGTGTCACATTTTGCTCA-3’，反向引物：5’-CTAAGGAGTGATACACCTCGTAGTTG-3’；β-actin正向引物：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，反向引物：5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。

1.2.4ELISA法檢測血清IL-17濃度按試劑盒使用說明進行操作，450nm處空白對照調零后測每孔吸光度(A)值。 橫坐標為標準品濃度，縱坐標為A值，將各標準品的坐標點連線，繪制成標準曲線，根據待測標本的A值在曲線上查找對應濃度，并乘以稀釋倍數后得出相應濃度。

2 結果

2.1眼前段照相觀察各組小鼠眼表變化情況眼前段照相結果顯示，OVA+霧化吸入組、OVA+灌胃組、RW+灌胃組、HDM+霧化吸入組表現為遇強光睜眼困難，其中HDM+霧化吸入組結膜囊內還可見大量黏液性分泌物；RW+霧化吸入組、HDM+灌胃組小鼠可見角膜及球結膜處絲狀黏液性分泌物伴倒睫；OVA+皮下注射組、RW+皮下注射組小鼠可見結膜囊內少量黏液性分泌物，眼瞼輕度水腫，睜眼情況較好、未見明顯倒睫(圖1)。

圖1 各組小鼠眼前段照相情況 A：空白對照組；B：OVA+皮下注射組；C：OVA+霧化吸入組；D：OVA+灌胃組；E：RW+皮下注射組；F：RW+霧化吸入組；G：RW+灌胃組；H：HDM+皮下注射組；I：HDM+霧化吸入組；J：HDM+灌胃組。

2.2小鼠結膜組織中IL-17和RANTESmRNA的表達情況各組小鼠結膜IL-17 mRNA相對表達水平差異有統計學意義(F=4.82，P=0.03)。各處理組小鼠結膜IL-17 mRNA相對表達水平均較空白對照組增高，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中RW+灌胃組增高最顯著(t=14.92，P=0.0008)；RW+皮下注射組增高程度最低(t=3.18，P=0.037)(圖2A)。各組小鼠結膜RANTES mRNA表達水平差異有統計學意義(F=7.18，P=0.01)。各處理組小鼠結膜RANTES mRNA相對表達水平均較空白對照組增高，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中RW+灌胃組增高最顯著(t=31.59，P<0.001)(圖2B)。上述結果提示，小鼠在生命早期階段多次皮下注射OVA和RW后，結膜組織中IL-17和RANTES mRNA相對表達水平增高的程度低于其他處理方式。

圖2 各組小鼠結膜組織IL-17和RANTES mRNA相對表達水平 aP<0.05, bP<0.01 vs 空白對照組。

2.3ELISA檢測血清IL-17濃度各組小鼠血清IL-17濃度差異有統計學意義(F=43.14，P<0.001)。與空白對照組相比，除OVA+霧化吸入組(t=1.86，P=0.116)和RW+皮下注射組(t=1.82，P=0.118)外，其余處理組小鼠血清IL-17濃度均增高，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中OVA+灌胃組(25.75±4.25pg/mL)、RW+灌胃組(26.16±5.08pg/mL)和HDM+霧化吸入組(26.70±5.79pg/mL)升高顯著(圖3)。上述結果提示，小鼠在生命早期階段多次霧化吸入OVA和多次皮下注射RW后，血清中IL-17濃度增高的程度低于其他處理方式。

圖3 各組小鼠血清中IL-17濃度 aP<0.05, bP<0.01 vs 空白對照組。

3 討論

目前，環境因素對于過敏性結膜炎的影響日益受到關注，而從“衛生假說”和免疫耐受的角度審視生命早期環境因素對于過敏性結膜炎的影響，對于更深入地認識過敏反應機制、制定新的預防和治療策略可能具有深遠的現實意義。因此，如在小鼠生命早期開始給予抗原暴露，且能構建較為穩定的免疫耐受狀態以減輕成年后對過敏原的反應性，則有利于針對臨床上如何避免形成易過敏體質、重新認識過敏性結膜炎的發生和發展以及制定新的預防和診治方法提供了一定的現實參考意義。故本研究將所有親代小鼠終生飼養于獨立通氣籠具(individual ventilated cages，IVC)系統中，確保新生小鼠僅能經特定的暴露方式暴露于特定抗原下，以保證實驗環境的可控制性。

IL-17不僅可發揮自身的促炎作用，還能與Th2發揮協同促炎作用[15]。研究顯示，IL-17缺陷小鼠的Th2細胞反應顯著降低，并且氣道嗜酸性粒細胞數目和活性下降[16]。此外，IL-17通過上調IL-13活性以激活STAT-6而參與過敏反應，這是IL-17同Th2細胞協同反應的首個被發現的機制[17]。C-C家族趨化因子RANTES可分別來自于血小板、單核細胞、嗜酸性粒細胞、上皮細胞，其通過募集T細胞、樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)、嗜酸性粒細胞、肥大細胞在過敏反應中發揮重要作用，其與免疫性疾病的嚴重程度相關[18-19]。在過敏性哮喘患者的肺組織和支氣管肺泡灌洗液中均有RANTES高表達，而抑制RANTES功能后，呼吸道嗜酸性粒細胞數量下降，氣道炎癥顯著改善[20]。RANTES與過敏性結膜炎的關系也得到證實。Leonardi等[21]用TNF-α刺激人結膜成纖維細胞24h后，RANTES和Th2細胞因子濃度均顯著增加。此外，末次滴眼激發6h后，棕色挪威大鼠(brown Norway rats，BN)結膜組織中未檢測到RANTES mRNA表達，而24h后，RANTES mRNA在結膜組織大量表達[22]。我們既往研究中利用小劑量RW多次皮下注射構建免疫耐受小鼠，其結膜組織中RANTES mRNA及蛋白表達水平、脾細胞懸液中IL-17濃度均低于陽性對照組(過敏性結膜炎組)，而睜眼情況、結膜水腫程度以及黏液分泌情況同陽性對照組相比均顯著改善，但不同條件下構建的免疫耐受狀態是否存在差異仍不得而知[14]。本研究在不同暴露方式下，發現小鼠眼表狀態均出現異常，結膜組織RANTES和IL-17 mRNA相對表達水平和血清IL-17濃度均上升，但經皮下注射的小鼠眼表狀態更為穩定，且RANTES和IL-17的表達受抑制程度均高于灌胃和霧化吸入，提示經皮下注射的小鼠免疫耐受程度較高。但不同抗原之間的差異難以直接觀察，故我們將重點討論不同暴露方式與過敏性結膜炎免疫耐受模型之間的關系。

小鼠胃腸道中的共生微生物及酶類既可發揮免疫調節功能(分泌趨化因子、細胞因子等)，又可對進入胃腸道的蛋白質、脂肪等物質進行酶解，破壞原有的結構和功能，但同時會產生新的蛋白質、多糖和多肽等物質，這些新物質亦具有免疫原性[23-24]。此外，隨著母乳喂養的結束，母乳中免疫球蛋白介導的被動免疫將減弱，腸道固有層和上皮層內的B細胞和T細胞數目將逐漸達到成人水平，因此，隨著年齡的增長，穩定和持久的免疫耐受狀態將難以構建[25]。Longo等[26]將60名5歲對牛奶過敏的兒童隨機分為試驗組和對照組，在1a時間內，試驗組從小劑量開始給予，并逐漸增加牛奶劑量；而對照組完全不給予牛奶，結果發現，試驗組11名兒童對牛奶耐受，16名可接受少量牛奶，3名仍對其過敏；而對照組仍全部對牛奶過敏，因此認為口服小劑量牛奶可誘導對牛奶過敏的兒童產生免疫耐受。本研究結果表明，經灌胃后的小鼠眼表體征較明顯，IL-17和RANTES表達受抑制程度較低，表明免疫耐受狀態相對較差。分析原因可能有以下幾點：(1)標準尺寸的灌胃針難以進入乳鼠食管，大量抗原物質無法進入胃腸道；(2)乳鼠胃容積很小且食管肌肉發育不完善，部分抗原經食管反流后被排出體外。

呼吸道誘導免疫耐受狀態的解剖學基礎為鼻相關淋巴組織，其中皺襞細胞(M細胞)可特異性攝取部分抗原，從而誘導免疫耐受[27]。Li等[28]給予4～5周齡A/J小鼠呼吸道滴入超敏肌鈣蛋白(cardiac troponin I，cTnI) 誘導免疫耐受狀態成功后構建實驗性自身免疫性心肌炎動物模型，結果顯示心肌細胞浸潤和纖維化程度、左心室功能部分恢復，血清IL-10濃度升高。其還發現，單次大劑量較多次小劑量可誘導更佳的免疫耐受狀態，且隨著抗原刺激間隔時間的延長，免疫耐受狀態的持續時間和穩定性會下降。但Jiang等[29]利用呼吸道滴入光感受器間視黃醇結合蛋白(interphotoreceptor retinoid binding protein，IRBP)誘導自身免疫性葡萄膜炎小鼠模型時卻發現，多次小劑量比單次大劑量誘導的免疫耐受狀態更穩定。盡管呼吸道存在內屏障以限制抗原，但經霧化處理后的抗原可緩慢入血，因此血液中抗原濃度低，需反復抗原刺激以維持免疫耐受狀態。吸入性免疫耐受狀態的維持更需要抗原持續性刺激，一旦停止吸入抗原，其免疫耐受狀態將逐漸消退甚至消失，故需通過反復吸入抗原維持其狀態[30]。因此，經霧化吸入的小鼠眼部體征及促炎因子表達高于經皮下注射小鼠的可能原因為腹腔注射和霧化吸入的時間間隔較長，免疫耐受狀態減弱。如縮短霧化吸入和腹腔注射、滴眼之間的時間間隔，應當能減輕小鼠眼表體征和促炎因子表達水平。

皮下注射的抗原可被細胞外基質緩慢吸收入血，并顯著延長注射抗原的Cmax持續時間。此外，間質淋巴管可直接將分子量>20×103Da的分子吸收，因此可直接進入淋巴系統[31]。Carton等[32]將主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)予以熒光標記后，將其與CD40結合可見大量DCs迅速移行至注射部位，且在二次注射時皮下淋巴結的中T細胞更易活化和增殖且記憶性T細胞可持續轉移至附近淋巴結。因此，持續注入皮下的抗原幾乎可完全被吸收而直接進入血液循環和淋巴循環，從而誘導出較穩定的免疫耐受狀態。

由于結膜屬于全身共有黏膜系統，其與呼吸道黏膜、消化道黏膜以及皮下黏膜組織具有相似的病理生理學機制，因此，某個部位的免疫狀態改變將引發遠端黏膜組織免疫狀態的改變[33-35]。盡管黏膜共有免疫是復雜的全身性免疫反應，但該現象在臨床中卻十分常見。如在日常工作中，從“衛生假說”、免疫耐受及黏膜共有免疫的角度理解過敏性結膜炎，可能會為其預防和診治提供新的思路和方式。本研究結果支持機體的免疫耐受狀態可在結膜組織中得到反映，但不同部位的黏膜組織對于刺激的反應效能以及抗原的處理能力存在差異。

總之，本研究是以“衛生假說”為理論基礎，即在生命早期階段接觸適量的寵物、蛋白類制品以及微生物對于機體的免疫調控發揮了保護性作用。目前針對過敏性結膜炎的治療仍以脫離過敏源，抑制炎癥反應為主，而較少關注生命早期環境對疾病的影響。因此，從“衛生假說”和免疫耐受的角度理解過敏性結膜炎的發生和發展，既有利于個人調整生活習慣以預防過敏性結膜炎，又可為過敏性結膜炎的公共預防和臨床治療提供新的思路。