表觀遺傳修飾參與糖尿病視網膜病變代謝記憶的研究進展

騫元婕，魏雁濤

0 引言

糖尿病視網膜病變(diabetes retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最嚴重的并發癥之一，也是工作年齡人群的主要致盲原因[1]，糖尿病視網膜病變的存在也意味著威脅生命的系統性血管并發癥的風險增加[2]。由于糖尿病視網膜病變早期癥狀常不明顯，容易被患者忽略而出現不可逆的視力損傷。因此實現糖尿病視網膜病變的早期診斷和治療尤為重要。血糖控制是糖尿病視網膜病變治療的關鍵環節，但大量的臨床以及實驗研究表明，糖尿病機體在結束高血糖刺激后，即使血糖控制良好，包括糖尿病視網膜病變在內的并發癥也較容易出現[3]。近年來研究發現表觀遺傳調控在“代謝記憶”的發生與進展中起著重要作用。因此，深入研究表觀遺傳學機制不僅可以為糖尿病視網膜病變的復雜調控機制提供新的線索，還可以為尋找新藥靶點及潛在的治療策略提供新的依據。本文將進一步就表觀遺傳學在糖尿病視網膜病變及相關“代謝記憶”中的作用及發展做出建議和展望。

1 代謝記憶現象

兩項大型臨床試驗，糖尿病控制和并發癥試驗(Diabetes Control and Complications Trial,DCCT)及糖尿病干預和并發癥流行病學(Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications, EDIC)研究，有力地證實了“代謝記憶”參與糖尿病視網膜病變的進展[4]。

DCCT試驗對招募的1型糖尿病患者進行了多中心的大型對照臨床試驗。強化治療組患者接受強化治療，每天注射3次或更多的胰島素，控制患者平均糖化血紅蛋白(HbA1c)約為7%；常規治療組患者參與者接受常規治療，每天注射1～2次胰島素，控制其平均HbA1c約為9%。經過長達10a的隨訪后，強化治療組患者視網膜病變風險較常規治療組顯著降低。隨后研究員又開展了EDIC研究。EDIC是一項長期的前瞻性、縱向、觀察性研究。EDIC研究中，原本接受強化治療和常規治療的患者都接受了強化治療，兩組患者的HbA1c水平迅速趨于相同[5]。但盡管早期血糖差異消失，常規治療組微血管并發癥的風險仍然高于早期強化血糖控制組，這種現象首次被DCCT/EDIC合作描述為“代謝記憶”[6]。代謝記憶的概念提出后，受到了越來越多人的關注，許多關于糖尿病視網膜病變的發病機制及生物標志物的研究層出不窮，探尋并拓展靶向治療或許可為糖尿病視網膜病變提供新的方法與思路。

2 表觀遺傳修飾在糖尿病視網膜病變代謝記憶中的作用

表觀遺傳修飾在DNA序列不改變的條件下，通過DNA甲基化、組蛋白修飾、miRNAs調節等方面改變基因的表達。在糖尿病機體中，表觀遺傳修飾常涉及炎癥反應、血管生成和細胞凋亡等因子，它們的表觀修飾增加了糖尿病視網膜病變發生的可能，使得部分糖尿病視網膜病變在血糖控制良好情況下仍難以緩解[7]。

2.1DNA甲基化DNA甲基化通常是指在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基團轉移到CpG二核苷酸簇(CpG島)胞嘧啶堿基的第五碳上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG島是與基因沉默相關的調控區[8]。目前發現，線粒體DNA(mtDNA)甲基化與糖尿病視網膜病變“代謝記憶”的發生密不可分，而mtDNA的正常復制和轉錄是維持線粒體功能的關鍵。

在糖尿病患者的細胞中mtDNA的合成和功能被破壞，mtDNA轉錄活性降低，使視網膜毛細血管周細胞和內皮細胞加速凋亡[9]。mtDNA有一個非編碼區，即置換環(D-loop)，具有重要的轉錄和復制元件，對活性氧(reactive oxygen species，ROS)高度敏感，極易受到氧化損傷。實驗研究發現，高糖刺激導致了人視網膜內皮細胞(HRECs)中5mC水平的升高，D-loop區隨之高甲基化，而正常糖處理后并不能逆轉，這種現象可以被DNMT-siRNA和DNMT抑制劑5-氮雜胞苷(5-AZA)阻止。同樣地高糖刺激增加了D-環中堿基錯配的水平，并且停止高糖刺激后無法逆轉。有趣的是，在高糖刺激后的正常糖處理的階段補充DNMT1-siRNA或5-AZA時，D-loop區的斷裂及堿基錯配現象減弱，說明抑制DNA的甲基化可以減少堿基錯配[10]。這表明DNA甲基化與堿基錯配之間可能存在著某種串擾現象，而在高糖刺激終止后，DNA甲基化和堿基錯配之間的串擾仍在繼續。串擾現象在mtDNA復制轉錄中極其重要，我們或許可以通過調節DNA的甲基化防止堿基的錯配和線粒體功能障礙，進而阻止糖尿病視網膜病變的進展。

此外，線粒體通過融合-裂變的動態變化來維持平衡，高糖刺激一方面會導致視網膜線粒體融合蛋白的減少[11]，另一方面高糖刺激也會抑制線粒體電子傳遞鏈復合體，線粒體電子傳遞鏈功能紊亂引起了ROS的積累，誘導mtDNA損傷從而釋放更多的ROS，繼續加重線粒體的破壞。這種惡性循壞參與了“代謝記憶”的進程[12]。由PPARGC1A編碼的過氧化物酶體增生物激活受體γ輔助激活因子(PGC-1α)，可通過與輔助激活過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR-α)的結合，調控線粒體融合蛋白以維持線粒體穩定和誘導線粒體抵抗ROS的攻擊。耿爽等[13]研究發現糖尿病大鼠視網膜組織PGC-1α mRNA表達減少，PGC-1α蛋白表達量下降；PPARGC1A啟動子區甲基化水平與對照組相比顯著升高，即使后期血糖控制在合理范圍內仍無法逆轉此現象。PGC-1α參與的高糖誘導線粒體功能障礙可能在代謝記憶中起著不可或缺的作用。因此針對DNA甲基化和mtDNA復制及修復機制的調控將成為一種減緩糖尿病視網膜病變進展的潛在治療策略。

2.2組蛋白修飾紊亂組蛋白是維持染色質結構的重要蛋白質，其尾部的翻譯后修飾(post-translational modifications, PTMs)包括甲基化、乙?；⒘姿峄?，改變了組蛋白與DNA 的親和性，使基因轉錄發生改變[14-15]。

有研究表明，核因子2相關因子2(Nrf2)通路參與了糖尿病視網膜病變“代謝記憶”的過程[16]。Nrf2是一種氧化還原敏感的轉錄因子, 對ROS具有防御作用。正常情況下，Kelch樣ECH關聯蛋白1(Keap1)與 Nrf2結合，在細胞質中抑制Nrf2的活性，使Nrf2處于“潛伏狀態”。 Nrf2在高糖刺激下轉位到細胞核，通過與抗氧化反應元件(ARE)4區結合調節γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)的表達，從而起到抗氧化作用[17-18]。GCLC是抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)合成的重要酶[19]。Mishra等[20]研究證明在糖尿病大鼠視網膜內皮細胞中Nrf2與GCLC-ARE4的結合減少，GCLC-ARE4上的 H3K4me2顯著增加，而 H3K4me3和 H3K4me1顯著降低，損害了其抗氧化防御系統；即使糖尿病大鼠在高血糖損害之后將血糖控制良好，此現象仍無法逆轉[21]。隨后，研究者通過細胞實驗發現賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1) siRNA可阻止高糖誘導的組蛋白甲基化改變，同時改善GCLC-ARE4和GCLC與Nrf2結合的減少[20]。這一現象提示以組蛋白甲基化為靶點的LSD1 siRNA有望幫助抑制或減緩糖尿病視網膜病變這種致盲的疾病。此外, Kowluru等[21]研究表明Nrf2激活劑dh404(CDDO-9，11-二氫三氟酰胺)，可以靶向增強Nrf2的抗氧化能力，阻止血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)以及炎癥介質如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等上調，降低糖尿病視網膜病變視網膜毛細血管的高通透性，保護Müller細胞免受損傷。靶向Nrf2的治療有希望成為抗VEGF的替代療法，成為精準控制糖尿病視網膜病變進展的一份子。

高糖引起的超氧化物歧化酶2(SOD2)基因的組蛋白修飾同樣與代謝記憶息息相關。Zhong等[22]研究發現在糖尿病大鼠視網膜內皮細胞中線粒體錳超氧化物歧化酶(MnSOD)的活性和基因表達降低。MnSOD具有清除自由基和抗氧化的功能，由SOD2基因編碼。隨后，在高糖培養的牛視網膜內皮細胞中發現SOD2基因轉錄減少，其啟動子和增強子上的H3K4me1和H3K4me2下降，并且在降低高糖后仍然無法逆轉。而當過表達MnSOD時，可以阻止高糖誘導的氧化應激物質8-羥基-2’-脫氧鳥苷水平和視網膜內皮細胞凋亡的增加。8-OHdG被認為是近年來生物體內DNA氧化損傷的一種新的敏感生物標志物[23]。此外，動物試驗中Xie等[24]進一步研究發現DNMT抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-AZA-DC)能有效抑制高糖條件下糖尿病大鼠視網膜組織DNMT的表達和活性，逆轉MnSOD的表達，從而使視網膜細胞免遭損傷。因此，針對抗氧化酶活性及組蛋白甲基化的調節可用來阻止高糖誘導的視網膜細胞凋亡，或許將為糖尿病視網膜病變今后的治療提供新的思路。

2.3miRNAs調節miRNAs是一種22bp左右的單鏈、內源性非編碼小RNA，已有研究表明miRNAs通過與目標基因的3’非翻譯區(3’-UTR)結合負調控基因的表達[25]。多項研究表明糖尿病視網膜病變與血液中miRNAs譜的明顯改變有關，有時在疾病出現前幾年就可以檢測到。由此可見，miRNAs可以作為生物標志物預測糖尿病視網膜病變的發生[26-27]。

研究證實，糖尿病大鼠視網膜中組蛋白去乙酰化酶Sirtuin 1(SIRT1)的表達受到抑制，而過表達SIRT1可恢復糖尿病大鼠視網膜微血管的通透性，減少mtDNA的損傷[28]。Zhao等[29]研究發現高糖處理一方面使人視網膜內皮細胞(HRECs)miR-23b-3p的表達上調，即使在恢復正常糖處理后也是如此；另一方面高糖可通過增加炎癥因子核因子κB乙?；?AC-NF-κB)來刺激miR-23b-3p的表達，而同時miR-23b-3p 又通過減少SIRT1來上調AC-NF-κB的表達，從而形成了miR-23b-3p/SIRT1/NF-κB反饋環。由于miRNAs本身受到轉錄因子的調節，又直接或間接靶向轉錄因子，所以miRNAs經常形成正反饋環[30]。實驗結果提示，抑制miR-23b-3p表達可能通過上調SIRT1的表達來挽救“代謝記憶”效應[29]， miR-23b-3p/SIRT1/NF-κB反饋環不僅可以早期診斷和監測疾病的進展，同時還可能成為糖尿病視網膜病變“代謝記憶”治療的新靶點。

近期研究發現miR-200b或許可成為預測糖尿病視網膜病變的生物標志物。Li等[31]在糖尿病視網膜病變患者中觀察到其視網膜miR-200b的表達降低，miR-200b通過負調控VEGFA和視網膜病變相關蛋白如轉化生長因子β1(TGF-β1)的表達進而抑制視網膜內皮細胞的增殖。與之相同，Dantas等[32]發現在2型糖尿病患者的血漿中miRNA-200b表達降低。但在增殖型糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者的玻璃體中，研究者發現miRNA-200b的表達相比于對照組增加[33]。研究結果的不同可能與2個因素有關：(1)由于相同的miRNAs在不同類型的細胞和組織中存在差異表達的情況；(2)由于不同研究選擇的研究模型也有所不同，并且各個糖尿病研究病程的長短不一也導致了研究結果之間的差異。兩項研究發現的差異說明miRNAs相關研究還存在著一定的局限性，未來仍需要大量的動物及臨床試驗使miRNA-200b等miRNAs調控糖尿病視網膜病變的網絡逐漸清晰化，在精準靶向治療上實現突破。

除此之外，當前研究表明在糖尿病大鼠中注射miR-146a可抑制NF-κB的激活及視網膜微血管的滲漏[34]，這提示過表達miR-146a可能是改善糖尿病視網膜病變的發生與進展有前途的靶點。目前多項研究發現某些miRNAs對視網膜的保護作用，基于RNA的療法也具有特異性靶向的潛在優勢。希望基于表觀遺傳學的快速發展，miRNAs能很快成為早期診斷手段的一部分，以此來預測糖尿病患者慢性并發癥的風險[35]。

3 總結與展望

面對世界范圍內糖尿病視網膜病變患病率的逐年增加，目前臨床如何高效、正確進行糖尿病視網膜病變的早期診斷與治療，仍然存在許多挑戰。諸多的臨床和實驗研究表明， “代謝記憶”會讓糖尿病患者早期體內不良血糖控制的有害影響持續多年，因此在疾病的初期階段制定治療方案極其必要。逆轉與代謝記憶相關的表觀遺傳修飾調節是治療糖尿病視網膜病變的潛在靶點，并且是開發早期診斷治療很有價值的目標。盡管目前仍有許多問題亟待解決，但其發展潛力不容小覷。表觀遺傳修飾相關酶的靶向調節，如DNMT抑制劑阿扎胞苷(Azacitidine,AZA)和地西他濱(Decitabine,DAC)[11]，HDACs抑制劑曲古菌素A(Trichostatin A,TSA)[36]等，部分已被美國食品和藥品監督管理局(FDA)批準，還有許多其他靶向藥物在臨床試驗中。另外值得注意的是，miRNAs的模擬物或抑制劑目前正廣泛應用于動物研究，它的優勢在于可以針對參與同一通路的多個基因進行調控，miRNAs調節劑可能是未來消除糖尿病視網膜病變發生風險最理想的早期治療方法之一。目前糖尿病視網膜病變表觀遺傳修飾機制尚未完全闡明，因此，未來仍需繼續探尋研究其分子機制以及miRNAs在糖尿病視網膜病變發生發展過程中的調控通路，并進一步探索其治療效果，進而為糖尿病視網膜病變的精確防治提供更多有效地選擇。