HPLC法測定諾氟沙星膠囊的有關物質

★李麗云 黎艷剛 朱海（云南省藥物研究所/云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室 昆明 650111）

諾氟沙星又稱氟哌酸，是人工合成的第三代喹諾酮類抗菌藥，1979年日本杏林制藥公司發現了該化合物并申請了專利。1983年該藥由默沙東作為申請人在意大利最初上市生產，當時采用片劑形式，商品名為Noroxin。1984年由杏林制藥作為申請人在日本上市生產，所用商品名為Baccidal，同樣采用片劑形式，該藥目前仍然在日本上市。諾氟沙星膠囊于1987年在國內上市，目前有批文690余條[1］，已有兩家制藥企業通過仿制藥質量和療效一致性評價。諾氟沙星在抗菌方面具備廣譜性，特別在抵抗需氧GNB（革蘭陰性桿菌）方面具備高效性，于體外可有效抑制腸桿菌科細菌中的多數菌屬，同時體外可抵御多種耐藥菌，對因敏感菌引發的尿路感染、傷寒、淋病、腸道感染、前列腺炎、其它沙門菌感染等具有治療作用[2］。

本文通過對中國藥典[3］所收載的諾氟沙星膠囊有關物質檢測方法及歐洲藥典所收載、參考文獻[4］所記載的諾氟沙星有關物質檢測方法進行了考察和對比，發現上述方法存在雜質控制不嚴、溶劑峰對主峰及雜質峰的測定產生干擾、梯度洗脫過程中容易出現基線波動等不足。因此，此項研究經色譜條件的篩選，完成諾氟沙星膠囊相關物質測定方法的建立，同時對其開展方法學驗證。

1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，奧豪斯EX125ZH電子天平，梅特勒 DELTA 320型pH計。

諾氟沙星對照品及雜質A對照品、環丙沙星（Ciprofloxacin）對照品、依諾沙星（Enoxacin）對照品，均購于中國食品藥品檢定研究院；諾氟沙星雜質D對照品及雜質2對照品均購于TLC公司；諾氟沙星雜質H對照品、雜質B對照品、雜質K對照品及雜質E對照品均購于CATO公司；諾氟沙星膠囊（自研）。甲醇為色譜純，水為純化水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用安捷倫 ZORBAX SB-C18色譜柱（5 μm× 4.6 mm×250 mm）；流動相A為0.015 mol/L磷酸溶液（由三乙胺將pH調節為3.0±0.1）-甲醇（85∶15），流動相B為甲醇，根據表1實施線性梯度洗脫處理；柱溫、流速分別設定為30 ℃、1.0 mL/min；測定波長為262 nm與278 nm。

2.2 溶液的配制

稀釋劑：即“2.1”項下的流動相A。

供試品溶液：取適量諾氟沙星膠囊內容物（與15 mg諾氟沙星相當），精密稱定，移至100 mL量瓶內，用2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再通過流動相A定容至100 mL，搖勻后濾過，即得供試品溶液。

各雜質對照品貯備液：分別取諾氟沙星雜質D、K、B、E 、2、A、H對照品約15 mg，精密稱定，移至100 mL量瓶內，用2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再通過流動相A定容至100 mL，搖勻，即得對照品貯備液。

峰定位溶液：取諾氟沙星對照品約15 mg，精密稱定，移至100 mL量瓶內，用2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，分別量取上述雜質對照品貯備液各4 mL，再通過流動相A定容至100 mL，搖勻，作為峰定位溶液。

系統適用性溶液：分別取環丙沙星對照品和依諾沙星對照品約15 mg，精密稱定，移至50 mL量瓶內，用2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，加流動相A定容至50 mL，搖勻；再取諾氟沙星對照品約15 mg，精密稱定，并移至100 mL量瓶內，用2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再加入1 mL上述混合液，之后通過流動相A定容至100 mL，搖勻，即得系統適用性溶液。

空白輔料溶液：取適量諾氟沙星空白輔料（與15 mg的諾氟沙星相當），精密稱定，再移至100 mL量瓶內，通過2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再通過流動相A定容至100 mL，搖勻后濾過，即得空白輔料溶液。

2.3 系統適用性試驗

取“2.2”項下制備的峰定位溶液、系統適用性溶液分別進樣，對色譜圖進行記錄。所得結果見圖1，系統適用性溶液和峰定位溶液中各雜質與主峰、雜質與雜質之間分離完全，分離度均大于2.0，理論塔板數均大于4 000，符合系統適用性要求。

2.4 專屬性試驗

2.4.1 輔料干擾試驗 取“2.2”項下制備的峰定位溶液、供試品溶液、空白輔料溶液與稀釋劑分別進樣，對色譜圖進行記錄。所得結果見圖1，各雜質峰處均未見空白輔料與稀釋劑出峰，表明輔料與溶劑皆不會影響對諾氟沙星膠囊的雜質測定。

圖1 典型色譜圖

2.4.2 強制降解試驗 取“2.2”項下供試品溶液和空白輔料溶液，分別置于2 mol/L鹽酸溶液中、105 ℃條件下酸破壞4 h；2 mol/L氫氧化鈉（NaOH）溶液內，105 ℃溫度時堿破壞4 h；30%雙氧水溶液0.1 mL中，105 ℃條件下氧化破壞3 h；105 ℃高溫下破壞24 h；光照（5 000±500）lx條件下1個月，處理完成后分別進樣，記錄色譜圖。結果表明諾氟沙星膠囊在酸、堿、氧化、高溫、光照條件下均相對穩定，產生的降解產物較少，各降解產物峰與諾氟沙星主峰能完全分離，峰純度合格，滿足專屬性強制破壞要求。

2.5 線性和范圍

取諾氟沙星對照品約15 mg，精密稱定，移至100 mL量瓶內，用2 mL鹽酸溶液（0.1 mol/L）溶解，再通過流動相A定容至100 mL，搖勻，即得諾氟沙星對照品貯備液；分別精密量取“2.2”項下各雜質對照品貯備液1 mL以及上述諾氟沙星對照品貯備液1 mL，移至25 mL量瓶內，通過流動相A定容至25 mL，搖勻，即得對照品混合溶液；對此混合液分別進行不同量的準確量取：0.01、0.015、0.02、0.03、0.04、0.06、0.1 mL，逐一移至液相色譜儀，對色譜圖進行記錄。橫坐標（X）、縱坐標（Y）分別為“對照品的進樣量（單位：ng）”“峰面積”，開展線性回歸，得到回歸方程與相關系數r。見表2。

2.6 定量限和檢測限

分別量取“2.2”項下各雜質對照品貯備液及“2.5”項下諾氟沙星對照品貯備液適量，用流動相A稀釋至信噪比為10∶1和3∶1的濃度，精密量取上述對照品溶液各0.02 mL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見表2。

表2 諾氟沙星及已知雜質的線性關系及靈敏度測定結果

2.7 精密度試驗

2.7.1 儀器精密度 精密量取1 mL“2.5”項下諾氟沙星對照品貯備液，移至25 mL量瓶內，用流動相A定容至25 mL，搖勻，即得對照品溶液。精密量取上述對照品溶液0.02 mL，注入液相色譜儀，共進行6次不間斷進樣，記錄色譜圖，通過主峰峰面積與保留時間的RSD波動，考察儀器于此色譜條件下的精密狀況。結果顯示，關于對照品溶液，其主峰峰面積、保留時間RSD值依次是1.88%、0.69%，可見儀器于此色譜條件下具備良好精密度表現。

2.7.2 重復性 依照“2.2”項下制備供試品溶液的方法，完成6份供試品溶液的制備，之后分別準確吸量0.5 mL，移至100 mL量瓶內，通過流動相A定容至100 mL，搖勻，即得對照溶液；分別準確吸量此對照溶液與供試品溶液0.02 mL，移入液相色譜儀，對色譜圖進行記錄，根據外標法，通過峰面積對已知雜質含量展開求解，得到雜質K的RSD值是1.97%，可見此法具備良好重復性。

2.7.3 中間精密度 依照“2.2”項下制備供試品溶液的方法，由不同操作者，借助不同儀器于不同時間，取12份批次相同的樣品進行重復檢測，考察方法的中間精密度，其中第1天的數據引用重復性項下的結果，結果顯示雜質K的RSD值等于3.93%，可見此法具備良好中間精密度。

2.8 準確度試驗

分別量取“2.2”項下各雜質對照品貯備液及“2.5”項下諾氟沙星對照品貯備液2 mL，移至50 mL量瓶內，通過流動相A定容至50 mL，搖勻，即得對照品混合貯備液；之后量取2.5 mL，移至50 mL量瓶內，通過流動相A定容至50 mL，搖勻，即得對照品混合溶液。取空白輔料適量，精密稱定，置50 mL量瓶中，分別加入對照品混合貯備液2.0、2.5和3.0 mL，通過流動相A定容至50 mL，搖勻后濾過，取續濾液制備不同濃度供試品溶液，低、中、高濃度依次為80%、100%、120%，各濃度皆重復配樣3份，分別移入液相色譜儀，對色譜圖進行記錄，借助外標法，經由峰面積對已知雜質含量展開計算。結果顯示，諾氟沙星雜質D、K、B、E、2、A、H及諾氟沙星的平均回收率為99.19%、107.95%、98.85%、103.43%、106.16%、106.05%、102.35%、99.04%，RSD值為0.60%、2.40%、1.28%、1.51%、1.28%、1.29%、0.98%、2.64%，表明本法檢查有關物質的準確度良好。

2.9 溶液穩定性試驗

依照“2.2”項下制備供試品溶液的方法進行供試品溶液的制備，靜置于室溫中，分別于0、4、8、12、16、20、24 h精密吸量上述樣品溶液0.02 mL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果顯示，供試品溶液內總雜質、最大單雜、已知雜質皆未見明顯改變，同時無新雜質形成，可見供試品溶液于室溫靜置24 h依然具備穩定性。

2.10 耐用性試驗

經由調整流速、流動相比例、磷酸鹽酸堿度、柱溫、廠家不同、批號不同的色譜柱來考察擬定色譜條件的耐用性。準確吸量0.02 mL供試品溶液，移至液相色譜儀，對色譜圖進行記錄。結果表明當流速變動±10%、柱溫變動±5 ℃、磷酸鹽pH值變動±0.2、流動相的比例變動±2%、改變色譜柱時，對測定結果不造成影響，說明本法對流速、柱溫、磷酸鹽pH值、流動相的比例、色譜柱的耐用性良好。

2.11 樣品測定

按照經方法學驗證的有關物質檢查方法，對自研諾氟沙星膠囊的有關物質進行檢查。見表3。

表3 關物質檢查結果………… %

3 討論

據文獻報道，河南省藥檢所于2018年對43批次諾氟沙星膠囊進行了有關物質專項監督抽驗，按現行標準檢測，部分批次的諾氟沙星膠囊主峰前有一雜質峰與主峰未完全分離，該雜質峰應為雜質E[5］；與此同時，浙江省臺州市藥檢所于2017年對57批次諾氟沙星膠囊進行了抽驗，有關物質研究結果發現，3個廠家的5批次樣品中檢出雜質E超標，1批檢出雜質K在限度邊緣[1］。因此，為有效控制產品質量，諾氟沙星膠囊的有關物質檢測方法需要修訂提高。

本研究是在《中國藥典》收載的諾氟沙星膠囊有關物質檢測方法的基礎上，對色譜條件進行了調整，經專屬性、線性、定量限和檢測限、精密度、準確度、耐用性等試驗的驗證后，確認該檢測方法不僅準確可靠，而且可以檢測出諾氟沙星的7個雜質，尤其是諾氟沙星原料于合成期間生成的雜質E和雜質K。如表3所示，自研的諾氟沙星膠囊中含0.12%的雜質K，說明該有關物質檢測方法更有利于控制原料藥及產品的質量。