林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤活性研究

黃丹，房慶偉，李坤，葉冠

(上海醫藥集團股份有限公司中央研究院，上海 201203)

人參為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根及根莖。人工種植的俗稱“園參”；播種在山林之間天然生長的稱“林下參”。人參莖葉為人參的干燥莖葉，主要有效活性成分是人參皂苷類化合物，如人參皂苷Rg2，人參皂苷Rg3，人參皂苷Rh2等[1]。研究證明人參莖葉總皂苷含量比人參的根部含量高約6%～12%，且所含人參皂苷的藥理活性與人參根所含皂苷基本相同[2-3]，具有開發潛力和經濟價值。由于野山參資源匱乏，近幾年我國大量種植林下參以滿足用藥需求。林下參的生長環境與野山參相似，其藥用價值優于園參，僅次于野山參[4-5]。目前林下參的主要研究利用部位還僅僅是根[6]，根的生長周期長，莖葉每年都可采摘，廉價易得，朱海林等[7]研究發現林下參葉總皂苷含量高于莖、根、籽。然而許多林下參莖葉作為廢棄物丟棄，沒有得到充分利用。目前對于林下參莖葉的藥理功效相關報道甚少，因此研究林下參莖葉的藥理活性具有重要的應用價值。

藥理實驗數據表明人參皂苷是園參根發揮抗腫瘤作用的主要活性成分[8]。15年以上的林下參與6年生的園參根中主要皂苷種類相似，含量差異較大[9]，14年生林下參的總皂苷含量高于6年生園參，接近10年生野山參的水平[10]，有報道稱林下參根也具有抗腫瘤活性[11-13]。張蘭蘭等[14]研究發現5年園參葉與5年、10年、16年林下參葉中皂苷類成分基本一致。園參莖葉總皂苷具有抗腫瘤、增強免疫等多種生物學功能[3,15-17]，為了驗證林下參莖葉的抗腫瘤功效，本研究建立了ICR小鼠H22移植瘤動物模型，重點比較林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤能力的差異，為林下參莖葉功效的進一步開發與利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物及H22瘤株

SPF級ICR小鼠100只，雌雄各半，6～8周齡，體質量18～20 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，生產許可證號：SCXK(遼)2020-0001，使用許可證號：SYXK(蘇)2017-0040。小鼠飼養在SPF級動物房，室溫(22±2)°C，濕度50%，自由進食、飲水。小鼠H22肝癌細胞由南京恩晶生物科技有限公司提供(貨號:EGC185)，于含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養。

1.2 主要藥品

園參莖葉總皂苷(人參莖葉總皂苷含量77.37%，人參皂苷Rg1、Re、Rd含量之和為34.06%);林下參莖葉總皂苷(人參莖葉總皂苷含量77.07%，人參皂苷Rg1、Re、Rd含量之和為37.46%)，均為實驗室自制，制法參考2020版《中國藥典》。實驗用園參莖葉及林下參莖葉樣品經葉冠教授級高級工程師鑒定為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥莖葉。參一膠囊購于吉林亞泰制藥股份有限公司(批號:20191203)。

1.3 主要試劑

D101大孔樹脂(國藥集團化學試劑有限公司，批號:20181127)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號:20181225)；免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素2(IL-2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫分析試劑盒(江蘇酶免實業有限公司，批號分別為MM-0057M1、MM-0058M1、MM-0182M1、MM-0701M1、MM-0132M1)；PE anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4、FITC anti-mouse CD8(北京四正柏生物科技有限公司，批號分別為4AD122130F、4AD122131F、4AD122131F)。

1.4 主要儀器

BHC-1300A/B2生物潔凈安全柜(蘇州凈化設備有限公司)；MCO-15AC二氧化碳培養箱(日本三洋SANYO)；XD-202熒光倒置生物顯微鏡(南京江南永新光學有限公司)；0-150型游標卡尺(臺灣西南佳華精密量具有限公司)；BSA 224S電子天平(德國賽多利斯公司)；熱電MultiskanFC酶標儀(Thermo)；SCILOGEX臺式高速冷凍離心機(SCILOGEX)；Attune NxT流式細胞儀(Thermo)。

1.5 造模及分組方法

取生長旺盛期的H22肝癌細胞，在無菌條件下，接種于90只ICR小鼠右側腋窩皮下，細胞接種量為1×106。造模周期2～3周。小鼠移植瘤用游標卡尺測量直徑，待腫瘤生長至100 mm3左右時,挑選生長狀態良好且腫瘤大小均一性較好的荷瘤裸鼠80只，隨機分成8組，每組10只，另外設置空白對照組，共9組。分別為空白對照組(NC組)、模型組(M組)、林下參莖葉總皂苷低劑量組(LXD組)、林下參莖葉總皂苷中劑量組(LXZ組)、林下參莖葉總皂苷高劑量組(LXG組)、園參莖葉總皂苷低劑量組(YSD組)、園參莖葉總皂苷中劑量組(YSD組)、園參莖葉總皂苷高劑量組(YSG組)及陽性對照組(SY組)。

1.6 藥物配制及給藥劑量

空白對照組和模型組，給予生理鹽水，按10 mL·kg-1灌胃給藥；林下參莖葉總皂苷低、中、高劑量組，園參莖葉總皂苷低、中、高劑量組，藥品皆用適量DMSO溶解后，生理鹽水稀釋，配制藥物濃度10、20、40 mg·kg-1，給藥體積0.2 mL·20 g-1，灌胃給藥。陽性對照組，參一膠囊每粒膠囊含人參皂苷10 mg，用生理鹽水溶解膠囊，用藥濃度10 mg·kg-1，給藥體積0.2 mL·20 g-1，灌胃給藥。1次/d，連續給藥14 d。

1.7 相對腫瘤增殖率、抑瘤率及免疫器官指數的測定

相對腫瘤增殖率T/C(%)、抑瘤率及免疫器官指數的測定方法參照文獻[18-19]。

1.8 小鼠外周血淋巴細胞及其亞群分布測定

流式細胞術檢測外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞。各組小鼠眼眶取血，取全血50 μL，依次加入CD3+-PE、CD4+-FITC、CD8+-FITC單克隆抗體，置于流式細胞儀檢測并計數，計算CD3+CD4+細胞與CD3+CD8+細胞的比例。

1.9 血清指標及細胞因子測定

ELISA方法檢測血清TNF-α、IFN-γ、IL-2、IgG、IgM水平。小鼠摘眼球取血，血液樣本經3 000 r·min-1離心10 min后，分離血清，測定血清中IgG、IgM；外周血檢測TNF-α、IFN-γ、IL-2的含量。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

整個實驗期間無小鼠意外死亡情況。隔天1次測量腫瘤直徑，給藥14 d后，小鼠處死當天(第15天)林下參莖葉總皂苷低、中、高劑量組對H22荷瘤小鼠的相對腫瘤增殖率T/C(%)分別為70.0%、51.0%、34.5%，抑瘤率分別為21.2%、43.1%、60.4%；園參莖葉總皂苷低、中、高劑量組對H22荷瘤小鼠的相對腫瘤增殖率T/C(%)分別為77.9%、60.3%、40.5%，抑瘤率分別為19.0%、37.8%、54.7%；陽性對照組對H22裸小鼠移植瘤的T/C(%)為30.5%，抑瘤率為62.7%。與模型組比較，受試藥物對H22荷瘤小鼠異種移植瘤生長均有一定的抑制作用，瘤重明顯減輕(P<0.01)；林下參莖葉總皂苷中、高劑量組的瘤重較園參莖葉總皂苷對應中、高劑量組明顯更低(P<0.05)，結果見表1。表明不同劑量林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷對H22荷瘤小鼠異種移植瘤生長均有一定的抑制作用，且林下參莖葉總皂苷中、高劑量組抗小鼠肝癌活性略強于園參莖葉總皂苷對應中、高劑量組。

表1 林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

2.2 對H22荷瘤小鼠免疫器官指數的影響

給藥14 d后，與模型組比較，林下參莖葉總皂苷高劑量組脾縮小，脾指數明顯降低(P<0.05)，林下參莖葉總皂苷高劑量組較園參莖葉總皂苷對應高劑量組脾指數明顯更低(P<0.05)，其他各組小鼠脾指數與模型組基本一致，差異無統計學意義(P>0.05)。同時，本實驗亦觀察H22荷瘤小鼠胸腺指數，結果顯示，給藥14 d后各組小鼠胸腺指數與模型組基本一致，差異無統計學意義(P>0.05)。林下參莖葉總皂苷高劑量組對小鼠脾臟免疫功能略有損傷，其他各組對ICR荷瘤小鼠免疫功能沒有顯著影響，結果見表2。

2.3 對H22荷瘤小鼠血液中CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞含量比例的影響

流式細胞術檢測CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞含量比例結果顯示，與空白對照組比，模型組小鼠血液CD3+CD4+含量比例明顯降低(P<0.01)；CD3+CD8+含量比例明顯升高(P<0.01)；與模型組比，陽性對照組，林下參莖葉總皂苷低、中、高劑量組和園參莖葉總皂苷低、中、高劑量組CD3+CD4+含量比例明顯升高，CD3+CD8+含量比例明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)，結果見表3。比較林下參莖葉總皂苷低、中、高劑量組與園參莖葉總皂苷對應低、中、高劑量組CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞含量比例，低劑量組CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞含量比例差異均有統計學意義(P<0.05)，中、高劑量組CD3+CD4+無明顯差異(P>0.05)，CD3+CD8+細胞含量比例差異有統計學意義(P<0.01)，表明林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷能顯著促進H22荷瘤小鼠血液中CD3+CD4+細胞的表達，降低CD3+CD8+細胞表達水平。

表2 林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷對H22荷瘤小鼠免疫器官指數影響

2.4 對H22荷瘤小鼠血清中細胞因子的影響

ELISA檢測結果顯示，模型組小鼠IgG、IgM、IFN-γ、IL-2、TNF-α水平與空白對照組小鼠比較顯著降低(P<0.01)；陽性對照組，林下參莖葉總皂苷低、中、高劑量組和園參莖葉總皂苷低、中、高劑量組小鼠IgG、IgM、IFN-γ、IL-2、TNF-α水平與模型組小鼠比較明顯升高(P<0.01)，結果見表4。園參莖葉總皂苷和林下參莖葉總皂苷對荷瘤小鼠免疫增強均有良好的效果，在同等劑量的情況下，林下參莖葉總皂苷的效果略優于園參莖葉總皂苷，IgG、IgM、IL-2、TNF-α結果差異有統計學意義(P<0.01)，IFN-γ高劑量無明顯差異(P>0.05)，中、低劑量差異有統計學差異(P<0.05)。

表3 林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷對H22荷瘤小鼠血液中CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞含量比例的影響

表4 林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷對H22荷瘤小鼠血清中的IgG 、IgM、 IFN-γ、IL-2、TNF-α水平比較

3 討論

肝癌在中醫癥狀中屬于“肝積”“臌脹”“脅痛”“虛勞”等范疇，多因氣滯、血瘀、毒聚等引起。機體正氣被逐漸損傷，導致肝脾陽虛，進而腎陰虧虛，形成惡性循環。如《金匱要略》所言：“夫治未病者，見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”，脾虛是肝癌病理病機的重中之重。人參入脾、腎經，具有補脾益肺、大補元氣的功效，能提升機體的免疫力。中醫理論認為，人參能輔助提高正氣，從而增強抗邪毒的能力。

參與機體細胞免疫的主要是T淋巴細胞，包括輔助性T淋巴細胞(CD3+CD4+)和細胞毒性T淋巴細胞(CD3+CD8+)，CD3+CD4+比值降低，CD3+CD8+占比上升提示機體免疫細胞受到抑制或損傷[20-21]。本研究顯示，林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷作用于H22荷瘤小鼠后，CD3+CD4+比值上升，CD3+CD8+細胞占比下降，說明林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷能激活CD3+CD4+細胞，增強細胞免疫，發揮抗肝癌作用。T淋巴細胞在惡性腫瘤發生的情況下會釋放細胞因子來調節免疫系統，TNF-α能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無害[22]，IFN-γ由活化的NK細胞和CD4+T細胞分泌，具有抗腫瘤，調節免疫的作用[23]，IL-2通過增強T淋巴細胞活性來調節細胞免疫[24]。林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷可以使荷瘤小鼠血清中IFN-γ、IL-2、TNF-α水平明顯升高，說明林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷能通過促進免疫細胞因子的產生，達到抗肝癌作用。血清中抗體IgG、IgM的含量直接反映體液免疫功能，林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷可以使荷瘤小鼠血清中IgG、IgM水平顯著上升，說明它們可以增強H22荷瘤小鼠體液免疫功能。

綜上所述，林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷可能通過增強免疫來抑制H22肝癌細胞的生長，林下參莖葉總皂苷中、高劑量組比園參莖葉總皂苷對應劑量組具有更強的抗腫瘤活性。本文研究結果可為開發針對肝細胞癌癥新型治療策略提供一定的線索，對進一步開發利用林下參莖葉資源具有重要意義，但需要更多的臨床研究證實林下參莖葉總皂苷在腫瘤治療中抑制腫瘤生長，增強細胞免疫的有效性，并探討詳細的調節機制。