左歸丸對早衰和初老大鼠下丘腦-垂體-卵巢FSHR、LHR和ER表達的影響

趙粉琴，趙艷，劉潔穎，茍雅姣，胡芝霞

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000)

下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO)調控卵巢的生殖和內分泌功能，下丘腦分泌促性腺激素釋放激素激動劑(GnRHa)，促進垂體前葉分泌促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)，FSH的生物學作用主要是促進卵巢卵泡的生長和卵泡顆粒細胞的增生，刺激卵泡細胞上LH受體產生；LH的生物學作用主要是促進卵泡的成熟和排卵，刺激卵泡內膜細胞產生雌激素，維持女性內分泌。

FSHR和LHR主要存在于卵巢顆粒細胞和卵泡膜細胞，是促性腺激素(Gn)及各類細胞因子調控卵泡發育、成熟及排卵的重要受體，GnRHa能抑制FSH對FSHR的誘導[1]，從而使卵巢FSHR表達及FSHR與FSH的結合量減少[2]，影響卵泡的發育和成熟,但是在FSHR和LHR下丘腦和垂體組織的表達未見相關報道。左歸丸作為經典補腎藥[3]，在防治生理性或功能性卵巢功能衰退(POF)方面研究較多，對下丘腦-垂體-卵巢激素受體表達未見報道。基于此本研究對不同階段大鼠體內血清(FSH、LH和E2)水平變化以及在下丘腦、垂體、卵巢不同部位表達的差異性以及左歸丸的干預作用進行研究，驗證左歸丸促進卵巢功能恢復的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SPF級SD大鼠，4～6月齡(青年,相對于人18～20歲)60只，11～12月齡(初老,相對于人40～45歲)40只，體質量(220±20)g。甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(甘)2015-0005。普通飲食、飲水，室溫18～25 ℃，相對濕度60%～70%，自然晝夜節律光照。

1.2 主要藥品和試劑

順鉑注射液(云南植物藥業有限公司，國藥準字H53021740)；補佳樂(拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，國藥準字J20130009)；性激素ELSIA試劑盒，LH(MM-0624R1)、FSH(MM-0566R1)、E2(MM-0575R1)均來自江蘇菲亞生物科技有限公司；一抗(GeneTex)：LHR(GTX64387,稀釋比例為1∶100，抗兔)，FSHR(GTX64391，稀釋比例為1∶100，抗兔)，ER(GTX22746，稀釋比例為1∶100，抗鼠)；DAB顯色試劑盒(中杉金橋)；二抗(中杉金橋)：生物素標記山羊抗鼠IgG(SP-9002)，生物素標記山羊抗兔IgG(SP-9001)；三抗(中杉金橋)，辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液(SP-9001)。

1.3 實驗動物模型制備、分組以及給藥

青年大鼠60只給予順鉑注射液6 mg/(kg·w)，共2次，建立卵巢早衰大鼠模型。空白組給予等劑量的生理鹽水腹腔注射。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、模型+補佳樂組、模型+左歸丸(低、中、高)劑量組,每組10只；另40只初老大鼠，隨機分成空白組，初老+左歸丸(低、中、高)劑量組，每組10只。補佳樂灌胃藥物劑量0.09 g/(kg·d)，制備成0.09 mg/mL；左歸丸劑量9.45 g/(kg·d)，制備左歸丸濃度煎劑為0.945 g生藥/mL，低劑量0.472 5 g生藥/mL,中劑量0.945 g生藥/mL,高劑量4.725 g生藥/mL。左歸丸組成為熟地黃、炒山藥、山萸肉、牡丹皮、澤瀉、茯苓，由甘肅中醫藥大學附屬醫院提供，每只大鼠灌胃2 mL/d，連續用藥21 d。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 大鼠血清性激素水平的檢測

治療結束后，心前區取血1.5 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清移入EP管，用96孔ELISA試劑盒檢測血清中FSH、E2和LH水平。

1.4.2 免疫組化法檢測大鼠下丘腦、垂體、卵巢組織中FSHR、LHR、ER蛋白表達

實驗結束，處死大鼠，分離下丘腦、垂體、卵巢，切片，脫水。3 %過氧化氫室溫避光作用20 min。正常山羊血清封閉液室溫作用30 min。倒去封閉液，滴加一抗(FSHR或LHR或ER)工作液(1∶100)，4 ℃ 孵育過夜。分別滴加生物素化二抗(SP試劑盒)、三抗，分別室溫作用30 min，再滴加DAB顯色液(1∶20)，室溫避光作用5 min，顯微鏡下控制顯色時間，一旦出現最佳顏色，使用蒸餾水停止其顯色反應，蘇木素復染，酒精脫水，中性樹膠封片。同時設染色對照，每張切片隨機選取5個不同區域。使用Image-Pro Plus軟件(6.0版)測量卵巢內組織中FSHR、LHR、ER陽性表達的平均光密度值(IOD)。

1.5 統計方法

2 結果

2.1 大鼠血清FSH、LH和E2含量變化

實驗過程中除正常組以外，其余各組有大鼠死亡。與空白組比較，早衰模型組大鼠血清FSH增高(P<0.01)，LH增高，E2降低，差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，模型+左歸丸高劑量組降低大鼠血清FSH水平(P<0.01)；與初老組比較，初老組+左歸丸高劑量組降低大鼠血清FSH水平(P<0.05)，結果見表1。

表1 各組大鼠血清FSH、LH和E2含量

2.2 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位FSHR、LHR和ER表達分析

2.2.1 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位FSHR表達分析

與空白組比較，模型組、初老組大鼠下丘腦、垂體和卵巢組織FSHR表達下降(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，補佳樂組、模型+左歸丸高劑量組、初老+左歸丸高劑量組大鼠下丘腦、垂體和卵巢組織的FSHR表達增加(P<0.01，P<0.05)；與初老組比較，初老+左歸丸高劑量組明顯增加下丘腦、垂體、卵巢組織FSHR表達(P<0.01)。結果見表2，圖1。

表2 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位FSHR表達分析

圖1 下丘腦、垂體和卵巢組織FSHR免疫組化表達 (×400)

2.2.2 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位LHR表達分析

與空白組比較，模型組、初老組大鼠下丘腦和垂體組織LHR表達下降(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，補佳樂組、模型+左歸丸(中、低劑量組)和初老+左歸丸低劑量組大鼠下丘腦和垂體組織LHR表達明顯降低(P<0.01)，而模型+左歸丸高劑量組和初老+左歸丸高劑量組大鼠下丘腦、垂體和卵巢組織LHR表達明顯增加(P<0.01)；與初老組比較，左歸丸(高、中劑量組)明顯增加大鼠垂體組織LHR表達(P<0.01)。結果見表3，圖2。

表3 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位LHR表達分析

2.2.3 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位ER表達分析

與空白組比較，模型組大鼠下丘腦和卵巢組織、初老組大鼠下丘腦和垂體組織ER表達下降(P<0.01)；與模型組比較，初老組、模型+左歸丸高劑量組和初老+左歸丸(高劑量)低大鼠下丘腦、模型+左歸丸(高、中劑量組)和初老+左歸丸(高、中、低劑量組)大鼠垂體和卵巢組織ER表達明顯增加(P<0.01)；與初老組比較，初老組+左歸丸(高、中、低劑量組)大鼠垂體組織ER表達明顯增加(P<0.01)，結果見表4，圖3。

表4 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位ER表達分析

圖3 下丘腦、垂體和卵巢組織ER免疫組化表達(×400)

3 討論

POF主要是卵泡數量減少，雌激素水平下降，出現一系列近期和遠期并發癥，嚴重影響女性生殖、生命健康[4]。女性生殖和內分泌功能由HPO軸的正負反饋調控，FSH和LH，優先激活它們在下丘腦-垂體-卵巢-子宮性腺軸中的同源受體發揮重要作用[5-6]，促進卵泡發育、成熟以及排卵，同時卵泡發育合成的E2，與其富含ER的下丘腦、垂體、卵巢和子宮組織[7]結合發揮作用[3]。所有激素在體內生理作用的強弱，除了與生物效應量呈正比，還受激素受體(R)活性度高低的影響[8]。

FSHR和LHR對卵巢卵泡的發育、成熟以及排卵起著重要調控作用，而且不受外源性雌激素含量的影響[9]。關于雌激素及其受體結合，在生殖系統、中樞神經系統和內分泌系統等發揮重要作用的報道很多[10-11]，尤其是FSHR和LHR是卵巢顆粒細胞膜表面的重要受體，兩者的表達水平與卵母細胞的成熟程度呈現正相關[12]，在相同年齡的情況下，ER水平低下其卵巢衰老更快，其功能退化更為明顯，反作用于腺垂體，腺垂體減少促卵泡素分泌[13]。研究認為FSHR 的缺陷會導致受體結合FSH 以及信號傳導的異常，配子生成障礙，導致不孕[14],因而研究卵巢功能早衰(POF)下丘腦-垂體-卵巢性腺軸上FSH受體(FSHR)、LH受體(LHR)以及雌激素受體(ER)含量變化就顯得尤為重要。

本研究采用順鉑腹腔注射致POF[15]，血清性激素水平結果顯示，早衰大鼠和初老大鼠血清FSH增高(P<0.05),LH增高，E2含量降低，但各組雌激素水平比較之間無差異(P>0.05)，因為雌激素不是判斷卵巢功能衰退的主要指標[16]。經治療后發現左歸丸能減少早衰和初老大鼠FSH和LH分泌，升高E2水平，促進各級卵泡發育，達到改善卵巢功能的目的，尤以左歸丸高劑量組作用顯著(P<0.05)。

通過免疫組化的組織病理學研究顯示，早衰大鼠和初老組大鼠下丘腦組織中FSHR和LHR表達明顯下降(P<0.05)，而初老組大鼠ER表達沒有下降。早衰大鼠和初老組大鼠垂體組織中LHR表達明顯下降(P<0.05)，而早衰大鼠FSHR沒有明顯變化，ER表達下降(P<0.05)；初老組大鼠FSHR表達明顯下降(P<0.05)，而ER沒有明顯變化。在卵巢組織早衰大鼠FSHR和ER表達明顯下降(P<0.05)，而LHR沒有明顯變化。說明卵巢功能衰退FSH和LH效應組織的相應FSHR和LHR含量表達減少早于雌激素受體。這與研究卵巢上位腺體功能的異常可能先于卵巢功能的衰退有關，與血清雌激素水平無關一致[17]。

因為下丘腦是雌激素正負反饋作用以及垂體負反饋作用的效應器，早衰和初老大鼠血清FSH和LH水平升高，雌激素水平下降，進而反饋性影響下丘腦、垂體和卵巢組織FSHR、LHR和ER含量，FSH、LH和雌激素作用強度降低，卵母細胞停止發育及閉鎖，雌激素合成下降，即POF狀態。

左歸丸作為經典補腎養血方劑，具有填精益髓功效[18]，切合腎主生殖，腎精虧虛乃天癸竭，形壞而無子之病機。本研究顯示左歸丸能上調下丘腦、垂體和卵巢組織FSHR和ER表達，提高FSH和雌激素作用效度，改善卵巢功能的作用。這可能與左歸丸有類雌激素樣作用，并能增加雌激素效應組織受體含量，促進雌激素與其特異性受體的結合，改善卵巢功能，同時是否與左歸丸有改善化療引起的氧化應激損傷，延緩衰老有關[19]。