雞矢藤乙醇提取液體外抑菌活性與體內(nèi)抗炎鎮(zhèn)痛作用研究

楊寧宇，江佳麗，梁淑熒，曾 琳，林紅英，陳進(jìn)軍，康丹菊

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】自2020 年起，促生長(zhǎng)類(lèi)藥物及抗生素類(lèi)飼料添加劑禁止使用于畜牧業(yè)，我國(guó)進(jìn)入全面“禁抗”時(shí)代。但“禁抗”的同時(shí)帶來(lái)一些問(wèn)題，如畜禽在飼養(yǎng)和生產(chǎn)過(guò)程中將更易受到病原菌感染，生長(zhǎng)速度也相對(duì)減緩［1-2］，因此尋找能夠促生長(zhǎng)的替抗品迫在眉睫。中草藥具有來(lái)源廣泛、藥效多樣、經(jīng)濟(jì)環(huán)保、毒副作用小、成本低廉、無(wú)抗藥性、無(wú)殘留等顯著優(yōu)勢(shì)［3-4］，成為畜禽飼料添加劑的理想替抗品。雞矢藤〔Paederia scandens(Lour.) Merr.〕是我國(guó)常見(jiàn)的一味中草藥，為茜草科雞矢藤屬植物，常以根或全草入藥，具有消食健胃、清熱解毒、止痛等功效［5］。探 討雞矢藤乙醇提取物的體外抑菌活性和體內(nèi)抗炎鎮(zhèn)痛作用，可為雞矢藤應(yīng)用于畜禽疾病防治奠定基礎(chǔ)，也可為開(kāi)發(fā)中草藥飼料資源提供參考。

【前人研究進(jìn)展】雞矢藤植物中含有多種生物活性物質(zhì)［6-7］，其中主要化學(xué)成分可分為環(huán)烯醚萜苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、三萜類(lèi)、苯丙素類(lèi)、烷烴、脂肪醇和脂肪酸類(lèi)［8-9］。研究表明，在動(dòng)物飼料中添加雞矢藤提取物不僅可以提高動(dòng)物的免疫力［10-11］、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)、改善厭食癥［12-13］，而且還對(duì)雞非酒精性脂肪肝病具有治療作用［14］，通過(guò)滴鼻給藥方式可促進(jìn)雞免疫器官的發(fā)育與增長(zhǎng)［5］。喻曉雁［15］從雞矢藤中提取出多種具有抗腫瘤作用的化合物；郭強(qiáng)等［16］研究證實(shí)，雞矢藤苷酸對(duì)SCG-7901 胃癌細(xì)胞有明顯抑制作用。此外，雞矢藤還具有消炎［17］、鎮(zhèn)痛［18］等多種功效。

【本研究切入點(diǎn)】雞矢藤資源豐富，取材便捷，在嶺南地區(qū)以消暑除濕功效而聞名。雷州半島常年光熱資源豐富，形成天然的熱應(yīng)激環(huán)境，畜禽長(zhǎng)期暴露于高溫濕熱環(huán)境中，機(jī)體健康易受影響。本研究旨在探索雞矢藤對(duì)動(dòng)物的藥理作用，以期為雷州半島畜禽的健康養(yǎng)殖提供優(yōu)質(zhì)的飼草保健資源。

【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究選取雞矢藤植株地上部分為試驗(yàn)材料，通過(guò)陰干方式使其干燥，用粉碎機(jī)粉碎，采用乙醇提取法獲得其提取物，研究并評(píng)價(jià)其體外抑菌活性及對(duì)試驗(yàn)小鼠的抗炎和鎮(zhèn)痛效果，為進(jìn)一步發(fā)掘雞矢藤的新用途、拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1雞矢藤 供試雞矢藤（地上部分），2020年11 月采摘于廣東海洋大學(xué)校園內(nèi)（21° 09' N、110° 18' E），經(jīng)吳鈿教授鑒定。本研究試驗(yàn)于廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1.2試驗(yàn)菌種 革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Esherichia coli）、沙門(mén)氏菌（Salmonella）；革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。各菌種由廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明小鼠150 只，體重18～22 g，雌雄各半，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.4主要試劑 分析純?cè)噭簼饬蛩帷⑷然F溶液、冰醋酸、濃鹽酸、鎂粉等；化學(xué)純?cè)噭旱饣洝?%硫酸溶液、1%鐵氰化鉀溶液、40%乙醇、三氯化鐵-鐵氰化鉀、10%鹽酸溶液、2%鹽酸溶液、氯仿、1%三氯化鐵溶液、1%氫氧化鈉溶液、1%角叉萊膠、二甲苯等；其他試劑：M-H 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB 肉湯、阿司匹林溶液。

1.1.5主要儀器設(shè)備 HK-860W 水冷式中藥粉碎機(jī)（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）、SY-CJ-2FD 雙人單面凈化工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、LDZF-50KB 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、SHZ-Ⅱ循環(huán)水多用真空泵（河南鞏義市英峪予華儀器廠）、RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海滬西儀器廠）、LRH-150B 生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1雞矢藤藥粉及提取液的制備 將雞矢藤洗凈、陰干、粉碎，過(guò)孔徑425 μm 的篩網(wǎng)，得到雞矢藤藥粉。稱(chēng)取100 g 藥粉，用40%乙醇溶液浸提24 h，經(jīng)6 層紗布過(guò)濾，得到濾液和濾渣；將濾渣按上述方法再次浸提，合并濾液，抽濾，濃縮，得到原生藥量為1 g/mL 的雞矢藤乙醇提取液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2雞矢藤乙醇提取液化學(xué)成分分析 采用顏色反應(yīng)和沉淀反應(yīng)，初步分析雞矢藤乙醇提取液中是否含有生物堿、黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、酚類(lèi)、鞣質(zhì)、甾體類(lèi)等化學(xué)成分［19-20］。

1.2.3雞矢藤乙醇提取液體外抑菌試驗(yàn)（1）藥敏試驗(yàn)：將4 種供試菌分別接種于M-H 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上活化。通過(guò)麥?zhǔn)媳葷岱ǎ瑢⒕号涑蓾舛葹?.5×108CFU/mL 的菌懸液。采用濾紙擴(kuò)散法進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)［21］。將直徑為6 mm 的藥敏紙片浸漬于提取液中，充分吸收藥液后取出，烘干，貼于涂有菌懸液的平板中心位置。每種供試菌重復(fù)3 個(gè)平板試驗(yàn)。以生理鹽水紙片作為對(duì)照，所有平板均置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，通過(guò)十字交叉法用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄抑菌圈大小，比較抑菌效果。

（2）最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定：采用二倍稀釋法檢測(cè)雞矢藤提取液的MIC［22］。取8 支無(wú)菌試管（編號(hào)為1～8），1～6 號(hào)試管分別加入1 000 μL 菌懸液，之后1 號(hào)試管再加入1 000 μL藥液，通過(guò)二倍稀釋法使1～6 號(hào)試管的藥物濃度依次為500、250、125、62.50、31.25、15.625 mg/mL；7 號(hào)試管僅加入1 000 μL 菌液作為陽(yáng)性對(duì)照，8 號(hào)試管加入1 000 μL 藥液作為陰性對(duì)照。所有試管密封置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，觀察試管內(nèi)菌液的渾濁度。

1.2.4雞矢藤 乙醇提取液對(duì)小鼠的抗炎作用研究（1）二甲苯致小鼠耳廓腫脹：取50 只小鼠，稱(chēng)重，隨機(jī)分為5 組，每組10 只，分別為空白對(duì)照（10 mL/kg 蒸餾水），陽(yáng)性對(duì)照（0.2 g/kg阿司匹林），雞矢藤乙醇提取液高、中、低劑量（10、5、2.5 g/kg）處理。每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃5 d，最后一次給藥30 min 后，于每只小鼠右耳正反面均涂抹二甲苯0.05 mL 致炎，左耳廓作為耳腫脹的空白對(duì)照，致炎1 h 后處死小鼠，沿耳廓線剪下雙耳，將雙耳廓重疊，用直徑8 mm 打孔器打孔取下耳片，分別稱(chēng)重，以左右耳片質(zhì)量差值表示腫脹度，按照下述公式計(jì)算小鼠耳廓腫脹度以及抑制率。

（2）角叉萊膠致小鼠足跖腫脹：取50 只小鼠，分組和給藥方案同1.2.4（1）。每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃4 d，第5 天向每只小鼠右后足足墊皮下注射1%角叉萊膠20 μL，致炎后再給各處理小鼠灌胃1 次相應(yīng)藥物，次日處死小鼠，剪取雙腳后精確稱(chēng)量，以左右后足質(zhì)量差值表示腫脹度，按照下述公式計(jì)算小鼠足跖腫脹度以及抑制率。

1.2.5雞矢藤乙醇提取液對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用研究 取50 只小鼠，分組和給藥方案同1.2.4（1）。每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃5 d，最后一次灌藥1 h 后向每只小鼠腹腔處注射0.6%醋酸溶液0.01 mL/g［19］。觀察15 min 內(nèi)各小鼠發(fā)生首次扭體的時(shí)間和扭體次數(shù)。小鼠出現(xiàn)腹部向內(nèi)凹、后肢伸展、臀部抬高等現(xiàn)象時(shí)，即為出現(xiàn)1 次扭體反應(yīng)。統(tǒng)計(jì)各處理小鼠出現(xiàn)的痛閾值和15 min 內(nèi)出現(xiàn)的總扭體數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS21.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算各處理數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；采用單因素方差分析的方法，比較不同處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞矢藤乙醇提取液的主要化學(xué)成分

根據(jù)顯色反應(yīng)結(jié)果（表1）可見(jiàn)，雞矢藤乙醇提取液中含有 氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)類(lèi)、酚類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、黃酮類(lèi)、香豆精、萜類(lèi)內(nèi)酯類(lèi)化合物等化學(xué)成分，均為植物提取物中常見(jiàn)的活性天然產(chǎn)物，具有抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤等多種功效；有機(jī)酸類(lèi)pH 值介于9～10 之間。

表1 雞矢藤乙醇提取液的化學(xué)成分檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of chemical components in ethanol extract from Paederia scandens

2.2 雞矢藤乙醇提取液的體外抑菌效果

2.2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果 接種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的平皿上細(xì)菌散亂生長(zhǎng)，未出現(xiàn)抑菌圈；而接種蠟狀芽孢桿菌的平皿上，藥敏紙片周?chē)鸁o(wú)菌落生長(zhǎng)，抑菌圈平均直徑為8.55 mm。由此可見(jiàn)，雞矢藤乙醇提取液能夠抑制蠟狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)，而其他3 種供試菌則對(duì)藥液不敏感（表2）。

表2 雞矢藤乙醇提取物的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of in vitro drug sensitivity test of ethanol extract from Paederia scandens

2.2.2MIC 測(cè)定結(jié)果 在MIC 測(cè)定結(jié)果中，僅500 mg/mL 藥液和陽(yáng)性對(duì)照菌液澄清透明，無(wú)肉眼可見(jiàn)懸浮物，其余試管液體渾濁，表明雞矢藤乙醇提取物在500 mg/mL 濃度下能夠抑制蠟狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖；在250、125、62.50、31.25、15.625 mg/mL 濃度下均無(wú)抑制作用（表3）。因此雞矢藤乙醇提物對(duì)蠟狀芽孢桿菌的MIC 為500 mg/mL。

表3 雞矢藤提取液對(duì)蠟狀芽孢桿菌的MICTable 3 MIC of the Paederia scandens extract against Bacillus cereus

2.3 雞矢藤乙醇提取液的抗炎作用

2.3.1對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抑制作用 雞矢藤乙醇提取液高、中劑量處理能夠有效抑制二甲苯引起的小鼠耳廓急性腫脹，與空白對(duì)照相比差異極顯著。高、中、低劑量處理對(duì)二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹的抑制率分別為55.00%、30.93%、1.57%，以高劑量處理的抑制作用最明顯；陽(yáng)性對(duì)照處理的抑制率為69.29%（表4）。可見(jiàn)，一定濃度的雞矢藤乙醇提取液對(duì)二甲苯致小鼠耳廓炎癥反應(yīng)具有緩解作用。

表4 不同濃度雞矢藤乙醇提取液對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抑制作用Table 4 Inhibitory effect of ethanol extract from Paederia scandens at different concentrations on xylene-induced ear swelling in mice

2.3.2對(duì)角叉萊膠致小鼠足跖腫脹的抑制作用 雞矢藤乙醇提取液高、中劑量處理能夠有效抑制角叉萊膠引起的小鼠足跖腫脹，與空白對(duì)照相比差異極顯著。高、中、低劑量處理對(duì)角叉萊膠引起的小鼠足跖腫脹抑制率分別為58.26%、49.74%、5.22%，以高劑量處理抑制作用最明顯；陽(yáng)性對(duì)照處理的抑制率為63.48%（表5）?？梢?jiàn)，一定濃度的雞矢藤乙醇提取液對(duì)角叉萊膠致小鼠足跖炎癥反應(yīng)具有緩解作用。

表5 不同濃度雞矢藤乙醇提取液對(duì)角叉萊膠致小鼠足跖腫脹的抑制作用Table 5 Inhibitory effect of ethanol extract from Paederia scandens at different concentrations on carrageenan-induced foot swelling in mice

2.4 雞 矢藤乙醇提取液對(duì)冰醋酸致小鼠疼痛的鎮(zhèn)痛效果

與空白對(duì)照相比，雞矢藤乙醇提取液高、中劑量處理的小鼠首次出現(xiàn)扭體反應(yīng)的潛伏期差異極顯著；低劑量處理則差異顯著。各處理15 min內(nèi)出現(xiàn)的扭體反應(yīng)總次數(shù)與空白對(duì)照相比較，差異均達(dá)極顯著（表6），表明一定濃度的雞矢藤乙醇提取液能夠緩解致痛小鼠的疼痛反應(yīng)。

表6 不同濃度雞矢藤乙醇提取液對(duì)冰醋酸致小鼠疼痛的鎮(zhèn)痛效果Table 6 Analgesic effect of ethanol extract of Paederia scandens at different concentrations on pain induced by glacial acetic acid in mice

3 討論

3.1 雞矢藤乙醇提取液化學(xué)成分

本研究通過(guò)顯色反應(yīng)對(duì)雞矢藤乙醇提取液的化學(xué)成分進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)其含有豐富的 黃酮類(lèi)、香豆精、萜類(lèi)等多種成分，與馬養(yǎng)民等［23］通過(guò)系統(tǒng)預(yù)試法和單項(xiàng)預(yù)試法所得到的結(jié)果相符。張書(shū)霞［24］分析發(fā)現(xiàn)雞矢藤莖、葉富含抗壞血酸、膳食纖維、鐵、銅、鈣、鎂等，以及谷氨酸、賴(lài)氨酸、天冬氨酸等18 種氨基酸。張曉峰等［25］證實(shí)雞矢藤提取物能夠降低糖尿病小鼠的血糖。可見(jiàn)，無(wú)論從營(yíng)養(yǎng)保健還是飼料添加劑的角度來(lái)看，雞矢藤均具有廣闊的發(fā)展前景。本研究初步確定雞矢藤乙醇提取液可能存在的化學(xué)成分，為雞矢藤乙醇提取液抗炎鎮(zhèn)痛活性成分的提取、分離、鑒定、純化和篩選工藝提供參考。

3.2 雞矢藤乙醇提取液體外抑菌效果

本研究制得的雞矢藤乙醇提取物對(duì)蠟狀芽孢桿菌有一定抑制作用，而對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌未見(jiàn)明顯抑制作用。這與王珺［22］、曾志紅等［26］的結(jié)果不一致，但與廖建良等［27］、陳忠等［28］試驗(yàn)結(jié)果相似，這可能與藥液預(yù)處理方法、試驗(yàn)條件等不同有關(guān)。雞矢藤乙醇提取物對(duì)蠟狀芽孢桿菌的MIC 為500 mg/mL。蕭棟等［29］用嫩雞矢藤提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 為625 mg/mL，老雞矢藤提取液的MIC 甚至更弱，表明植株的生長(zhǎng)階段、采摘季節(jié)、取樣部位均有可能對(duì)其化學(xué)成分種類(lèi)、含量及抑菌活性產(chǎn)生影響。

3.3 雞矢藤乙醇提取液抗炎作用

二甲苯致小鼠耳廓腫脹法和角叉萊膠致小鼠足跖腫脹法是急性炎癥試驗(yàn)中常用的動(dòng)物模型［30］，其主要機(jī)理是通過(guò)化學(xué)刺激劑使機(jī)體局部毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性增加，導(dǎo)致出現(xiàn)局部充血、水腫和滲出等病理現(xiàn)象［30-32］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雞矢藤乙醇提取液高、中劑量處理對(duì)2 種炎癥小鼠模型均具有較好的抑制作用，提示一定劑量的雞矢藤乙醇提取液對(duì)致炎小鼠具有顯著抗炎作用。王昶等［33］研究發(fā)現(xiàn)，雞矢藤水煎液抑制二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹，降低由醋酸引起的小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性，表明雞矢藤水煎液和乙醇提取液均具有一定抗炎作用，但同一濃度下，雞矢藤乙醇提取液對(duì)小鼠耳廓腫脹度的抑制程度較高，這提示同一種植物采用不同提取劑提取，其提取液中含有的抗炎成分與含量有所不同。

3.4 雞矢藤乙醇提取液鎮(zhèn)痛作用

扭體法是試驗(yàn)常用的外周性疼痛模型，是篩選非甾體抗炎藥鎮(zhèn)痛藥物的簡(jiǎn)便方法。本試驗(yàn)結(jié)果表明，雞矢藤乙醇提取液各劑量處理均能延長(zhǎng)小鼠首次出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時(shí)間和減少15 min 內(nèi)小鼠的總扭體次數(shù)，表明雞矢藤乙醇提取液對(duì)痛覺(jué)具有顯著抑制作用。陳宇峰［18］研究表明，雞矢藤提取物中含有的各種糖類(lèi)和環(huán)烯醚萜苷類(lèi)物質(zhì)在濃度為800 mg/mL 時(shí)鎮(zhèn)痛效果明顯。目前雞矢藤多用于人結(jié)腸炎等消化道疾病的治療，緩解部分疾病引起的疼痛癥狀［34］，但尚無(wú)用于我國(guó)獸醫(yī)行業(yè)的報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果可為雞矢藤制品應(yīng)用于病畜臨床上的抗炎鎮(zhèn)痛提供參考。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)化學(xué)成分預(yù)試法初步判定雞矢藤乙醇提取液中含有氨基酸、多肽或蛋白類(lèi)、酚類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、黃酮類(lèi)、香豆精、萜類(lèi)內(nèi)酯類(lèi)化合物等多種活性物質(zhì)，具有潛在的抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫增強(qiáng)等藥理學(xué)功效；但抗菌譜窄，在4 種供試菌中，雞矢藤乙醇提取液僅對(duì)蠟狀芽孢桿菌生長(zhǎng)具有一定的抑制活性，抑菌圈直徑為8.55 mm，MIC 為500 mg/mL；分別以5、10 g/kg劑量連續(xù)灌胃，能夠顯著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹和角叉萊膠引起的小鼠足跖腫脹，抑制率為55.00%和58.26%，且能顯著延長(zhǎng)冰醋酸引起的小鼠首次出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時(shí)間，減少小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)?？梢?jiàn)，一定劑量的雞矢藤乙醇提取液對(duì)致炎和致痛小鼠模型具有顯著的抗炎和鎮(zhèn)痛效果。雞矢藤有望作為雷州半島優(yōu)質(zhì)飼草資源或飼料添加劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖行業(yè)。