雞矢藤乙醇提取液體外抑菌活性與體內抗炎鎮痛作用研究

楊寧宇，江佳麗，梁淑熒，曾 琳，林紅英，陳進軍，康丹菊

（廣東海洋大學濱海農業學院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】自2020 年起，促生長類藥物及抗生素類飼料添加劑禁止使用于畜牧業，我國進入全面“禁抗”時代。但“禁抗”的同時帶來一些問題，如畜禽在飼養和生產過程中將更易受到病原菌感染，生長速度也相對減緩［1-2］，因此尋找能夠促生長的替抗品迫在眉睫。中草藥具有來源廣泛、藥效多樣、經濟環保、毒副作用小、成本低廉、無抗藥性、無殘留等顯著優勢［3-4］，成為畜禽飼料添加劑的理想替抗品。雞矢藤〔Paederia scandens(Lour.) Merr.〕是我國常見的一味中草藥，為茜草科雞矢藤屬植物，常以根或全草入藥，具有消食健胃、清熱解毒、止痛等功效［5］。探 討雞矢藤乙醇提取物的體外抑菌活性和體內抗炎鎮痛作用，可為雞矢藤應用于畜禽疾病防治奠定基礎，也可為開發中草藥飼料資源提供參考。

【前人研究進展】雞矢藤植物中含有多種生物活性物質［6-7］，其中主要化學成分可分為環烯醚萜苷類、黃酮類、揮發油類、三萜類、苯丙素類、烷烴、脂肪醇和脂肪酸類［8-9］。研究表明，在動物飼料中添加雞矢藤提取物不僅可以提高動物的免疫力［10-11］、促進胃腸蠕動、改善厭食癥［12-13］，而且還對雞非酒精性脂肪肝病具有治療作用［14］，通過滴鼻給藥方式可促進雞免疫器官的發育與增長［5］。喻曉雁［15］從雞矢藤中提取出多種具有抗腫瘤作用的化合物；郭強等［16］研究證實，雞矢藤苷酸對SCG-7901 胃癌細胞有明顯抑制作用。此外，雞矢藤還具有消炎［17］、鎮痛［18］等多種功效。

【本研究切入點】雞矢藤資源豐富，取材便捷，在嶺南地區以消暑除濕功效而聞名。雷州半島常年光熱資源豐富，形成天然的熱應激環境，畜禽長期暴露于高溫濕熱環境中，機體健康易受影響。本研究旨在探索雞矢藤對動物的藥理作用，以期為雷州半島畜禽的健康養殖提供優質的飼草保健資源。

【擬解決的關鍵問題】本研究選取雞矢藤植株地上部分為試驗材料，通過陰干方式使其干燥，用粉碎機粉碎，采用乙醇提取法獲得其提取物，研究并評價其體外抑菌活性及對試驗小鼠的抗炎和鎮痛效果，為進一步發掘雞矢藤的新用途、拓寬其應用領域提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1雞矢藤 供試雞矢藤（地上部分），2020年11 月采摘于廣東海洋大學校園內（21° 09' N、110° 18' E），經吳鈿教授鑒定。本研究試驗于廣東海洋大學濱海農業學院動物醫學臨床實驗室完成。

1.1.2試驗菌種 革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Esherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）；革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。各菌種由廣東海洋大學濱海農業學院動物醫學微生物實驗室提供。

1.1.3試驗動物 健康昆明小鼠150 只，體重18～22 g，雌雄各半，購自廣東省醫學實驗動物中心，適應性飼養1 周后進行試驗。

1.1.4主要試劑 分析純試劑：濃硫酸、三氯化鐵溶液、冰醋酸、濃鹽酸、鎂粉等；化學純試劑：碘化汞鉀、5%硫酸溶液、1%鐵氰化鉀溶液、40%乙醇、三氯化鐵-鐵氰化鉀、10%鹽酸溶液、2%鹽酸溶液、氯仿、1%三氯化鐵溶液、1%氫氧化鈉溶液、1%角叉萊膠、二甲苯等；其他試劑：M-H 營養瓊脂、LB 肉湯、阿司匹林溶液。

1.1.5主要儀器設備 HK-860W 水冷式中藥粉碎機（廣州市旭朗機械設備有限公司）、SY-CJ-2FD 雙人單面凈化工作臺（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、LDZF-50KB 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）、SHZ-Ⅱ循環水多用真空泵（河南鞏義市英峪予華儀器廠）、RE-52 旋轉蒸發儀（上海滬西儀器廠）、LRH-150B 生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）等。

1.2 試驗方法

1.2.1雞矢藤藥粉及提取液的制備 將雞矢藤洗凈、陰干、粉碎，過孔徑425 μm 的篩網，得到雞矢藤藥粉。稱取100 g 藥粉，用40%乙醇溶液浸提24 h，經6 層紗布過濾，得到濾液和濾渣；將濾渣按上述方法再次浸提，合并濾液，抽濾，濃縮，得到原生藥量為1 g/mL 的雞矢藤乙醇提取液，于4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2雞矢藤乙醇提取液化學成分分析 采用顏色反應和沉淀反應，初步分析雞矢藤乙醇提取液中是否含有生物堿、黃酮類、環烯醚萜類化合物、蛋白質、有機酸、酚類、鞣質、甾體類等化學成分［19-20］。

1.2.3雞矢藤乙醇提取液體外抑菌試驗（1）藥敏試驗：將4 種供試菌分別接種于M-H 營養瓊脂平板上活化。通過麥氏比濁法，將菌液配成濃度為1.5×108CFU/mL 的菌懸液。采用濾紙擴散法進行體外藥敏試驗［21］。將直徑為6 mm 的藥敏紙片浸漬于提取液中，充分吸收藥液后取出，烘干，貼于涂有菌懸液的平板中心位置。每種供試菌重復3 個平板試驗。以生理鹽水紙片作為對照，所有平板均置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，通過十字交叉法用游標卡尺測量并記錄抑菌圈大小，比較抑菌效果。

（2）最小抑菌濃度（MIC）測定：采用二倍稀釋法檢測雞矢藤提取液的MIC［22］。取8 支無菌試管（編號為1～8），1～6 號試管分別加入1 000 μL 菌懸液，之后1 號試管再加入1 000 μL藥液，通過二倍稀釋法使1～6 號試管的藥物濃度依次為500、250、125、62.50、31.25、15.625 mg/mL；7 號試管僅加入1 000 μL 菌液作為陽性對照，8 號試管加入1 000 μL 藥液作為陰性對照。所有試管密封置于培養箱中培養24 h 后，觀察試管內菌液的渾濁度。

1.2.4雞矢藤 乙醇提取液對小鼠的抗炎作用研究（1）二甲苯致小鼠耳廓腫脹：取50 只小鼠，稱重，隨機分為5 組，每組10 只，分別為空白對照（10 mL/kg 蒸餾水），陽性對照（0.2 g/kg阿司匹林），雞矢藤乙醇提取液高、中、低劑量（10、5、2.5 g/kg）處理。每天灌胃1 次，連續灌胃5 d，最后一次給藥30 min 后，于每只小鼠右耳正反面均涂抹二甲苯0.05 mL 致炎，左耳廓作為耳腫脹的空白對照，致炎1 h 后處死小鼠，沿耳廓線剪下雙耳，將雙耳廓重疊，用直徑8 mm 打孔器打孔取下耳片，分別稱重，以左右耳片質量差值表示腫脹度，按照下述公式計算小鼠耳廓腫脹度以及抑制率。

（2）角叉萊膠致小鼠足跖腫脹：取50 只小鼠，分組和給藥方案同1.2.4（1）。每天灌胃1 次，連續灌胃4 d，第5 天向每只小鼠右后足足墊皮下注射1%角叉萊膠20 μL，致炎后再給各處理小鼠灌胃1 次相應藥物，次日處死小鼠，剪取雙腳后精確稱量，以左右后足質量差值表示腫脹度，按照下述公式計算小鼠足跖腫脹度以及抑制率。

1.2.5雞矢藤乙醇提取液對小鼠的鎮痛作用研究 取50 只小鼠，分組和給藥方案同1.2.4（1）。每天灌胃1 次，連續灌胃5 d，最后一次灌藥1 h 后向每只小鼠腹腔處注射0.6%醋酸溶液0.01 mL/g［19］。觀察15 min 內各小鼠發生首次扭體的時間和扭體次數。小鼠出現腹部向內凹、后肢伸展、臀部抬高等現象時，即為出現1 次扭體反應。統計各處理小鼠出現的痛閾值和15 min 內出現的總扭體數。

1.3 數據分析

采用SPSS21.0 軟件處理數據，計算各處理數據的平均值和標準差；采用單因素方差分析的方法，比較不同處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 雞矢藤乙醇提取液的主要化學成分

根據顯色反應結果（表1）可見，雞矢藤乙醇提取液中含有 氨基酸、多肽或蛋白質類、酚類、鞣質類、黃酮類、香豆精、萜類內酯類化合物等化學成分，均為植物提取物中常見的活性天然產物，具有抗氧化、鎮痛、抗菌、抗腫瘤等多種功效；有機酸類pH 值介于9～10 之間。

表1 雞矢藤乙醇提取液的化學成分檢測結果Table 1 Detection results of chemical components in ethanol extract from Paederia scandens

2.2 雞矢藤乙醇提取液的體外抑菌效果

2.2.1藥敏試驗結果 接種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的平皿上細菌散亂生長，未出現抑菌圈；而接種蠟狀芽孢桿菌的平皿上，藥敏紙片周圍無菌落生長，抑菌圈平均直徑為8.55 mm。由此可見，雞矢藤乙醇提取液能夠抑制蠟狀芽孢桿菌的生長，而其他3 種供試菌則對藥液不敏感（表2）。

表2 雞矢藤乙醇提取物的體外藥敏試驗結果Table 2 Results of in vitro drug sensitivity test of ethanol extract from Paederia scandens

2.2.2MIC 測定結果 在MIC 測定結果中，僅500 mg/mL 藥液和陽性對照菌液澄清透明，無肉眼可見懸浮物，其余試管液體渾濁，表明雞矢藤乙醇提取物在500 mg/mL 濃度下能夠抑制蠟狀芽孢桿菌的生長繁殖；在250、125、62.50、31.25、15.625 mg/mL 濃度下均無抑制作用（表3）。因此雞矢藤乙醇提物對蠟狀芽孢桿菌的MIC 為500 mg/mL。

表3 雞矢藤提取液對蠟狀芽孢桿菌的MICTable 3 MIC of the Paederia scandens extract against Bacillus cereus

2.3 雞矢藤乙醇提取液的抗炎作用

2.3.1對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抑制作用 雞矢藤乙醇提取液高、中劑量處理能夠有效抑制二甲苯引起的小鼠耳廓急性腫脹，與空白對照相比差異極顯著。高、中、低劑量處理對二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹的抑制率分別為55.00%、30.93%、1.57%，以高劑量處理的抑制作用最明顯；陽性對照處理的抑制率為69.29%（表4）。可見，一定濃度的雞矢藤乙醇提取液對二甲苯致小鼠耳廓炎癥反應具有緩解作用。

表4 不同濃度雞矢藤乙醇提取液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抑制作用Table 4 Inhibitory effect of ethanol extract from Paederia scandens at different concentrations on xylene-induced ear swelling in mice

2.3.2對角叉萊膠致小鼠足跖腫脹的抑制作用 雞矢藤乙醇提取液高、中劑量處理能夠有效抑制角叉萊膠引起的小鼠足跖腫脹，與空白對照相比差異極顯著。高、中、低劑量處理對角叉萊膠引起的小鼠足跖腫脹抑制率分別為58.26%、49.74%、5.22%，以高劑量處理抑制作用最明顯；陽性對照處理的抑制率為63.48%（表5）。可見，一定濃度的雞矢藤乙醇提取液對角叉萊膠致小鼠足跖炎癥反應具有緩解作用。

表5 不同濃度雞矢藤乙醇提取液對角叉萊膠致小鼠足跖腫脹的抑制作用Table 5 Inhibitory effect of ethanol extract from Paederia scandens at different concentrations on carrageenan-induced foot swelling in mice

2.4 雞 矢藤乙醇提取液對冰醋酸致小鼠疼痛的鎮痛效果

與空白對照相比，雞矢藤乙醇提取液高、中劑量處理的小鼠首次出現扭體反應的潛伏期差異極顯著；低劑量處理則差異顯著。各處理15 min內出現的扭體反應總次數與空白對照相比較，差異均達極顯著（表6），表明一定濃度的雞矢藤乙醇提取液能夠緩解致痛小鼠的疼痛反應。

表6 不同濃度雞矢藤乙醇提取液對冰醋酸致小鼠疼痛的鎮痛效果Table 6 Analgesic effect of ethanol extract of Paederia scandens at different concentrations on pain induced by glacial acetic acid in mice

3 討論

3.1 雞矢藤乙醇提取液化學成分

本研究通過顯色反應對雞矢藤乙醇提取液的化學成分進行初步分析，發現其含有豐富的 黃酮類、香豆精、萜類等多種成分，與馬養民等［23］通過系統預試法和單項預試法所得到的結果相符。張書霞［24］分析發現雞矢藤莖、葉富含抗壞血酸、膳食纖維、鐵、銅、鈣、鎂等，以及谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸等18 種氨基酸。張曉峰等［25］證實雞矢藤提取物能夠降低糖尿病小鼠的血糖。可見，無論從營養保健還是飼料添加劑的角度來看，雞矢藤均具有廣闊的發展前景。本研究初步確定雞矢藤乙醇提取液可能存在的化學成分，為雞矢藤乙醇提取液抗炎鎮痛活性成分的提取、分離、鑒定、純化和篩選工藝提供參考。

3.2 雞矢藤乙醇提取液體外抑菌效果

本研究制得的雞矢藤乙醇提取物對蠟狀芽孢桿菌有一定抑制作用，而對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌未見明顯抑制作用。這與王珺［22］、曾志紅等［26］的結果不一致，但與廖建良等［27］、陳忠等［28］試驗結果相似，這可能與藥液預處理方法、試驗條件等不同有關。雞矢藤乙醇提取物對蠟狀芽孢桿菌的MIC 為500 mg/mL。蕭棟等［29］用嫩雞矢藤提取液對金黃色葡萄球菌的MIC 為625 mg/mL，老雞矢藤提取液的MIC 甚至更弱，表明植株的生長階段、采摘季節、取樣部位均有可能對其化學成分種類、含量及抑菌活性產生影響。

3.3 雞矢藤乙醇提取液抗炎作用

二甲苯致小鼠耳廓腫脹法和角叉萊膠致小鼠足跖腫脹法是急性炎癥試驗中常用的動物模型［30］，其主要機理是通過化學刺激劑使機體局部毛細血管擴張、通透性增加，導致出現局部充血、水腫和滲出等病理現象［30-32］。本試驗結果顯示，雞矢藤乙醇提取液高、中劑量處理對2 種炎癥小鼠模型均具有較好的抑制作用，提示一定劑量的雞矢藤乙醇提取液對致炎小鼠具有顯著抗炎作用。王昶等［33］研究發現，雞矢藤水煎液抑制二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹，降低由醋酸引起的小鼠腹腔毛細血管通透性，表明雞矢藤水煎液和乙醇提取液均具有一定抗炎作用，但同一濃度下，雞矢藤乙醇提取液對小鼠耳廓腫脹度的抑制程度較高，這提示同一種植物采用不同提取劑提取，其提取液中含有的抗炎成分與含量有所不同。

3.4 雞矢藤乙醇提取液鎮痛作用

扭體法是試驗常用的外周性疼痛模型，是篩選非甾體抗炎藥鎮痛藥物的簡便方法。本試驗結果表明，雞矢藤乙醇提取液各劑量處理均能延長小鼠首次出現扭體反應的時間和減少15 min 內小鼠的總扭體次數，表明雞矢藤乙醇提取液對痛覺具有顯著抑制作用。陳宇峰［18］研究表明，雞矢藤提取物中含有的各種糖類和環烯醚萜苷類物質在濃度為800 mg/mL 時鎮痛效果明顯。目前雞矢藤多用于人結腸炎等消化道疾病的治療，緩解部分疾病引起的疼痛癥狀［34］，但尚無用于我國獸醫行業的報道。本試驗結果可為雞矢藤制品應用于病畜臨床上的抗炎鎮痛提供參考。

4 結論

本研究通過化學成分預試法初步判定雞矢藤乙醇提取液中含有氨基酸、多肽或蛋白類、酚類、鞣質類、黃酮類、香豆精、萜類內酯類化合物等多種活性物質，具有潛在的抗氧化、鎮痛、抗腫瘤、免疫增強等藥理學功效；但抗菌譜窄，在4 種供試菌中，雞矢藤乙醇提取液僅對蠟狀芽孢桿菌生長具有一定的抑制活性，抑菌圈直徑為8.55 mm，MIC 為500 mg/mL；分別以5、10 g/kg劑量連續灌胃，能夠顯著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹和角叉萊膠引起的小鼠足跖腫脹，抑制率為55.00%和58.26%，且能顯著延長冰醋酸引起的小鼠首次出現扭體反應的時間，減少小鼠扭體反應次數。可見，一定劑量的雞矢藤乙醇提取液對致炎和致痛小鼠模型具有顯著的抗炎和鎮痛效果。雞矢藤有望作為雷州半島優質飼草資源或飼料添加劑應用于畜禽養殖行業。