新會(huì)柑果汁發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素技 術(shù)研究

吳林達(dá)，林興奮，黃曉慧，陸鳳珍，梁鈺欣，楊毅紅

（電子科技大學(xué)中山學(xué)院材料與食品學(xué)院，廣東 中山 528400）

【研究意義】細(xì)菌纖維素（Bacterial cellulose,BC）是一類由葡萄糖單元通過β-1,-4 糖苷鍵連接組成的高分子聚合物［1］，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、吸水性及可生物降解性等優(yōu)點(diǎn)［2］。傳統(tǒng)以椰汁為原料制備細(xì)菌纖維素成本較高［3］，因此尋求質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的培養(yǎng)原料替代椰汁具有較好的市場(chǎng)前景。新會(huì)柑肉作為生產(chǎn)新會(huì)陳皮的副產(chǎn)物，通常被大量廢棄從而導(dǎo)致環(huán)境污染，探索以其作為主要原料制備BC 膜，對(duì)提高當(dāng)?shù)剞r(nóng)副產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益具有重要意義，同時(shí)可為新會(huì)廢棄柑肉的資源化利用提供新思路。【前人研究進(jìn)展】在新會(huì)柑肉資源化利用方面，有食品公司利用酵母菌和醋酸菌發(fā)酵柑汁，并制成新會(huì)柑酵素等食品［4］，或?qū)⑿聲?huì)柑果汁發(fā)酵成飲料［5］，或?qū)⒏涕僭鳛樵习l(fā)酵BC 膜［6］。王瑋瑜［7］研究用西瓜汁和蘋果汁生產(chǎn)出了性能良好的BC 膜，表明果汁等原料制備BC 有較好的技術(shù)可行性。木醋桿菌和紅茶菌是發(fā)酵BC 常用的菌種［8-10］，紅茶菌主要由酵母菌、醋酸菌和少數(shù)乳酸菌組成，可通過發(fā)酵產(chǎn)生葡萄糖醛酸、纖維素等成分［11-13］；而pH是影響B(tài)C 產(chǎn)率的重要因素之一，pH 為6.0～7.0可有效提高BC 產(chǎn)率［13］。關(guān)于BC 膜的應(yīng)用方面，改良后的BC 膜具備抗菌、防紫外線功能等新的性能特征，可應(yīng)用于生物醫(yī)療輔料促進(jìn)傷口愈合或可降解包裝材料等方向［2,14］。【本研究切入點(diǎn)】前人對(duì)BC 培養(yǎng)方式的研究表明，不同培養(yǎng)條件下BC 產(chǎn)率存在差異，如西瓜汁生產(chǎn)BC 的產(chǎn)率是蘋果汁的1.9 倍［7］，經(jīng)紫外誘變及篩選后的木醋桿菌生產(chǎn)BC 的產(chǎn)率提升了4.8 倍［8］，酶解后柑橘渣生產(chǎn)BC 的產(chǎn)率提高了2.2 倍［6］。由此可見，不同的原材料、菌種及培養(yǎng)方式均會(huì)對(duì)BC的產(chǎn)率以及性質(zhì)產(chǎn)生明顯的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以新會(huì)柑肉果汁為主要原料制備BC 膜，通過單因素分析及膜性能表征，探究新會(huì)柑果汁作為生產(chǎn)BC 原料的可行性，可為新會(huì)柑肉的開發(fā)利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：紅茶菌，購于紅茶菌酵素有限公司。

種子培養(yǎng)基(g/L)：紅茶葉10 g，蔗糖100 g，蒸餾水1 000 mL，煮沸5 min 后將茶葉撈出，于高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃條件下滅菌15～20 min，滅菌后冷卻置4 ℃下冷藏保存。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，磷酸氫二鈉8 g，磷酸二氫鉀5 g，硫酸鎂2 g，檸檬酸2.0 g，以新會(huì)柑果汁補(bǔ)足至1 000 mL。用0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至6.8～7.0，置于高壓蒸汽滅菌鍋 121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻后在4 ℃下冷藏保存［15］。

主要儀器：恒溫振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；BPG-9106A 精密鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；珠江牌培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；手提式折光儀，東莞三量量具有限公司；PHS-3C-02 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)，上海三信儀表廠；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵，鞏義市子華儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；梅特勒-托利多系列電子天平，梅特勒-托利多國際有限公司；日立S-4800 掃描電子顯微鏡，日本Hitachi 公司；傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司；X 射線衍射儀，德國國布魯克公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1柑肉預(yù)處理 將新會(huì)柑剝皮、去核分離出來的柑肉榨汁后，經(jīng)0.425 mm 篩網(wǎng)分離出多余的果渣。分別在柑汁中添加0.1%（W/V）的果膠酶、纖維素酶、纖維素+果膠酶［15］，室溫下攪拌均勻且酶解12 h 后，置于高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃下滅菌20 min，分別得到純柑汁、果膠酶解液、纖維素酶解液、纖維素+果膠酶解液（即培養(yǎng)原液），于4 ℃下冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2菌種活化與靜態(tài)培養(yǎng) 接入10 mL 紅茶菌菌液至種子培養(yǎng)基，并置于恒溫振蕩器中，28 ℃、120 r/min 條件下培養(yǎng)48 h 完成活化，將菌種保存于4 ℃的冰箱中備用。按培養(yǎng)基 10% (V/V) 的接種量接入活化菌種后，使用封口膜封口處理，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃下靜置培養(yǎng)11 d［7］。

1.2.3單因素試驗(yàn) 在1.1發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別改變檸檬酸添加量、發(fā)酵時(shí)間、pH 及培養(yǎng)原液，探究其對(duì)BC 膜產(chǎn)率的影響［8,15］：（1）pH分別設(shè)置為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他營養(yǎng)成分不變；（2）檸檬酸添加量分別設(shè)置為0、2、4、6、8 g/L，其他營養(yǎng)成分不變，調(diào)整pH 為 6.8～7.0；（3）發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)置為9、11、13、15、17 d，培養(yǎng)原液營養(yǎng)成分不變，調(diào)整pH 為6.8～7.0；（4）培養(yǎng)原液分別設(shè)置為純柑汁、纖維素酶解液、果膠酶解液、纖維素+果膠酶解液，其他營養(yǎng)成分不變，調(diào)整pH 為6.8～7.0。單因素試驗(yàn)的培養(yǎng)條件依照1.2.2 的靜態(tài)培養(yǎng)法，培養(yǎng)出的細(xì)菌纖維素膜按照1.2.4 的步驟進(jìn)行純化，按1.3.2 的干膜產(chǎn)率計(jì)算方法評(píng)價(jià)細(xì)菌纖維素產(chǎn)率，確定紅茶菌最佳發(fā)酵條件。

1.2.4纖維素膜的純化 將靜態(tài)培養(yǎng)的BC 膜用流水沖洗10 min 后，置于0.1 mol/L NaOH 溶液中煮沸 30 min，至呈現(xiàn)白色半透明狀態(tài)，然后用蒸餾水沖洗至濕膜表面pH 為 7.0 左右［7］。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1糖度、pH 測(cè)定及BC 膜評(píng)價(jià) 分別用手提式折光儀和pH 計(jì)測(cè)定柑汁及酶解液的糖度和pH值。采用干膜產(chǎn)率、含水率和復(fù)水率評(píng)價(jià)BC 膜。用濾紙拭去膜表面水分并稱重，得到濕膜質(zhì)量；再將其置于烘箱中50 ℃下干燥12 h，稱量，得到干膜質(zhì)量［7］。稱量BC 膜的濕膜、干膜質(zhì)量后，計(jì)算BC 產(chǎn)率及含水率［16］。干膜稱重后，于培養(yǎng)皿中用蒸餾水浸泡24 h，用濾紙拭去其表面水分，稱重，計(jì)算BC 膜的復(fù)水率。

美國依阿華州立大學(xué)個(gè)人理財(cái)專業(yè)碩士課程包括:家庭理財(cái)基礎(chǔ)，個(gè)人所得稅，家庭保險(xiǎn)計(jì)劃，家庭、員工福利與退休計(jì)劃，家庭遺產(chǎn)計(jì)劃，投資。而本科課程包括:家庭系統(tǒng)、理財(cái)咨詢、理財(cái)案例研究、家庭經(jīng)濟(jì)學(xué)、家庭理財(cái)專業(yè)實(shí)踐、家庭理財(cái)中的房地產(chǎn)、綜合實(shí)踐。

1.3.2紅外光譜（FTIR）和掃描電鏡（SEM）觀察 測(cè)試前將4 種培養(yǎng)原液生產(chǎn)出的BC 膜分別置于50 ℃烘箱內(nèi)烘干30 min，冷卻至室溫后加入適量KBr 粉末研磨，混合均勻后壓片，以分辨率4、掃描范圍400～4 000 cm-1條件下進(jìn)行紅外光譜掃描，并進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索比對(duì)［17］。

分別剪取邊長為1～1.2 cm 的四方形BC 膜貼于導(dǎo)電膠上，置于真空鍍膜機(jī)內(nèi)進(jìn)行表面噴金1 min，于掃描電鏡中，在觀察電壓為5 kV 條件下進(jìn)行觀察［10,17］。

1.3.3X 射線衍射（XRD）BC 膜于50 ℃烘干后，冷卻并研磨至粉末狀，取適量粉末置于X 射線衍射儀，在 40 kV 高壓、Cu 靶、管流設(shè)置為 40 mA、衍射角度2θ 為5°～50°檢測(cè)條件下進(jìn)行XRD掃描，并用jade 軟件檢索標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［17-18］，計(jì)算結(jié)晶度（CI）：

式中，Iam為非結(jié)晶區(qū)衍射角度2θ 為18°時(shí)的強(qiáng)度值，I020為衍射最高強(qiáng)度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑汁不同預(yù)處理前后基本特征的變化

未經(jīng)酶解處理的新榨柑汁含有較多果膠和纖維，柑汁經(jīng)3 次過濾后仍渾濁粘稠；而經(jīng)酶解預(yù)處理后的柑汁澄清，底部出現(xiàn)黃色絮狀沉淀。由圖1 可知，純柑汁、果膠酶解液、纖維素酶解液、纖維素+果膠酶解液的糖度分別為10.9%、7.1%、6.9%、8.2%，酶解后的糖度均低于未酶解處理的糖度，其原因可能是未經(jīng)滅菌處理的柑汁本身存在有酵母菌等嗜糖性的微生物，酶解時(shí)間過長導(dǎo)致微生物生長消耗一部分糖分使得糖度降低；酶解液的pH 與純柑汁沒有明顯差異，均為偏酸性。

圖1 不同培養(yǎng)原液的pH 及糖度對(duì)比Fig.1 Comparison of pH and Brix of different culture solution

2.2 BC 產(chǎn)率的單因素分析

由圖2A 可知，柑汁未添加檸檬酸時(shí)BC 產(chǎn)率最大，在檸檬酸添加量達(dá)到4 g/L 時(shí)無BC 產(chǎn)生。在發(fā)酵培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)中添加檸檬酸的原因是檸檬酸參與紅茶菌的三羧酸循環(huán)，進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)換和能量代謝，可有效提升紅茶菌的新陳代謝能水平，從而提高BC 產(chǎn)率［15,19］；但檸檬酸過高，三羧酸循環(huán)的反饋機(jī)制增強(qiáng)，可能導(dǎo)致產(chǎn)率下降，由于新會(huì)柑含有大量以檸檬酸為主的有機(jī)酸，對(duì)于柑汁培養(yǎng)基而言，額外添加檸檬酸對(duì)BC 膜產(chǎn)率起抑制作用。為避免添加檸檬酸導(dǎo)致pH 再變化，本研究在添加檸檬酸之后統(tǒng)一調(diào)整pH 至6.8～7.0，以消除檸檬酸對(duì)pH 的影響。

由圖2B 可知，pH 對(duì)BC 膜的產(chǎn)率具有明顯影響，當(dāng)pH 為6.0 時(shí)BC 膜產(chǎn)率最高，pH 在5.0～7.0之間的變化相對(duì)較小，偏離此范圍后產(chǎn)率快速下降。紅茶菌適合在弱酸性的培養(yǎng)環(huán)境中生長，發(fā)酵液最佳的初始pH 在6.0 附近［13］。對(duì)柑汁預(yù)先進(jìn)行酶解處理，在產(chǎn)率上沒有明顯優(yōu)勢(shì)，反而略低于純柑汁作為培養(yǎng)原液的產(chǎn)率。

由圖2C 可知，在一定時(shí)間范圍內(nèi)BC 產(chǎn)率與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)，在15 d 到達(dá)峰值后呈下降趨勢(shì)。原因可能是紅茶菌生產(chǎn)的BC 膜也是其代謝所需要的碳源，當(dāng)培養(yǎng)液中的碳源耗盡時(shí)，紅茶菌對(duì)BC 膜消耗速率高于分泌速率［20］。由圖2D可知，酶解預(yù)處理對(duì)產(chǎn)率無明顯促進(jìn)作用，不同預(yù)處理培養(yǎng)原液的BC 產(chǎn)率依次為純柑汁＞果膠酶+纖維素酶解液＞纖維素酶解液＞果膠酶解液。

圖2 不同因素對(duì)BC 產(chǎn)率的影響Fig.2 Effects of different factors on BC yield

2.3 BC 膜的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1含水率及復(fù)水率 如圖3 所示，不同培養(yǎng)原液生產(chǎn)的BC 膜均呈黃褐色半色透明的水凝膠狀，經(jīng)純化后呈白色透明凝膠狀，烘干后干膜呈紙片狀。由圖4 可知，4 種培養(yǎng)原液制備的BC 膜含水率均在98%以上，復(fù)水率均高于75%，具有重要基團(tuán)頻率分析對(duì)比，在1 127 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰代表C-O 鍵的伸縮振動(dòng)，2 875 cm-1附近的吸收峰代表C-H 鍵的伸縮振動(dòng)，3 350 cm-1附近區(qū)域的吸收峰則反映O-H 基的伸縮振動(dòng)，表明BC 膜主要存在O-H 基、C-H 鍵和C-O 鍵［17］。樣品圖譜經(jīng)本地?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索對(duì)比，結(jié)果表明該物質(zhì)為纖維素。良好的持水性能和復(fù)水性能，有利于活性物質(zhì)吸附的變性處理［21-22］。

圖3 BC 膜處理前后的直觀變化Fig.3 Intuitive change diagram of BC membrane before and after treatments

圖4 不同培養(yǎng)原液的BC 膜含水率及復(fù)水率對(duì)比Fig.4 Comparison of water content and rehydration rate of BC membrane with different culture solutions

2.3.2紅外光譜表征分析 由圖5 可知，不同培養(yǎng)原液的紅外光譜均存在3 處明顯的吸收峰，經(jīng)

圖5 細(xì)菌纖維素的紅外光譜Fig.5 Infrared spectrum of bacterial cellulose

2.3.3X 射線衍射分析 以強(qiáng)度為縱軸、衍射角為橫軸，將不同培養(yǎng)原液培產(chǎn)出的BC 膜進(jìn)行XRD 掃描，由X 射線衍射譜圖（圖6）可知，3個(gè)衍射角度14.1°、16.5°、22.9°分別代表纖維素結(jié)構(gòu)的（01）、（11）和（002）3 個(gè)晶面的衍射峰［17-18］，經(jīng)Jade 軟件檢索分析得出該樣品為纖維素，化學(xué)式為（C6H10O5）n；不同培養(yǎng)原液產(chǎn)出的BC 膜的結(jié)晶度均在80%以上。BC 膜的結(jié)晶度越高，其纖維的伸拉強(qiáng)度、密度也會(huì)相應(yīng)增大，同時(shí)因結(jié)構(gòu)致密，外部的水分子不易進(jìn)入纖維內(nèi)部，吸水性、柔軟性及化學(xué)活性會(huì)相應(yīng)降低。

圖6 細(xì)菌纖維素的XRD 譜圖和結(jié)晶度對(duì)比Fig.6 XRD pattern and crystallinity comparison of bacterial cellulose

2.3.4BC 膜的微觀結(jié)構(gòu) 由圖7 可知，4 種不同培養(yǎng)原液產(chǎn)出的BC 膜均有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但其纖維的結(jié)晶形態(tài)表現(xiàn)出較大的差異，其中純柑汁產(chǎn)出的BC 膜纖維較為纖細(xì)、具有多孔隙特征（圖7A），果膠酶解液產(chǎn)出的BC 膜纖維呈棱柱狀（圖7B），而纖維素酶解液、纖維素+果膠酶解液產(chǎn)出的BC 膜則分別呈現(xiàn)出球形和方形結(jié)構(gòu)（圖7C、D）；所有BC 膜的纖維直徑均在80～400 nm之間，與王珊珊等［19］試驗(yàn)所得的BC 膜相比，纖維直徑基本一致，但本研究中BC膜表面存在球形、方形纖維團(tuán)和棱柱狀纖維束的形態(tài)，不同微觀結(jié)構(gòu)的生成機(jī)制仍有待探究。

圖7 不同培養(yǎng)原液產(chǎn)出的BC 膜的SEM 圖Fig.7 SEM images of BC membranes produced by different culture solutions

3 討論

新會(huì)柑果汁中除含糖分和有機(jī)酸外還存在纖維和果膠類物質(zhì)［23］，本研究結(jié)果表明，經(jīng)果膠酶和纖維素酶酶解處理后的柑汁糖度下降而pH基本不變。研究表明，用纖維素和果膠酶處理柑橘果渣后，BC 產(chǎn)率有明顯提高［15］，而本研究酶解處理新會(huì)柑果汁后，BC 產(chǎn)率反而下降。結(jié)合相關(guān)研究［15,17］分析，其產(chǎn)率下降的原因可能是酶解時(shí)間過長導(dǎo)致糖分消耗下降，嗜糖的紅茶菌因后期可利用的糖分減少而導(dǎo)致BC 膜產(chǎn)率下降。紅茶菌為復(fù)合菌種，多次傳代后BC 的產(chǎn)率不穩(wěn)定。因此從紅茶菌中篩選出適應(yīng)酸性果汁環(huán)境的高產(chǎn)菌種，并建立相應(yīng)的發(fā)酵模型是未來新會(huì)柑果汁生產(chǎn)BC 的探索途徑之一［10］。

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，以純柑汁為原料，在不添加檸檬酸且發(fā)酵時(shí)間為15 d、pH 為6.0 的條件下可有效提高BC 膜的產(chǎn)率。與前人生產(chǎn)條件［13,15,19］相比，本研究不同點(diǎn)是無需添加檸檬酸且發(fā)酵時(shí)間偏長。推測(cè)原因可能是過多的檸檬酸導(dǎo)致紅茶菌三羧酸循環(huán)的負(fù)反饋機(jī)制增強(qiáng)［19］，從而使得產(chǎn)率下降；不同的培養(yǎng)原料和菌種會(huì)導(dǎo)致達(dá)到BC 最大產(chǎn)率所需的時(shí)間不同。以新會(huì)柑果汁為原料生產(chǎn)BC 需添加堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH，但其成本將提高，因此尋求廉價(jià)的堿性調(diào)節(jié)劑或適應(yīng)酸環(huán)境的優(yōu)勢(shì)菌種是新的研究方向。

不同碳源產(chǎn)出的BC 膜可能具有不同的微觀結(jié)構(gòu)，從而影響B(tài)C 膜的物理性能［22］。有研究表明，以秸稈水解液生產(chǎn)的BC 膜在SEM 圖下呈現(xiàn)超細(xì)纖維的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［24］。本研究以不同培養(yǎng)原液產(chǎn)出的BC 膜在SEM 圖則呈現(xiàn)出不同的纖維排列形態(tài)和結(jié)晶狀態(tài)，具體表現(xiàn)在SEM 圖出現(xiàn)了類似方形、球形、棱柱狀的纖維素，但其作用機(jī)制尚未明確。結(jié)合復(fù)水性能、紅外光譜和X 射線衍射得出，各培養(yǎng)原液培養(yǎng)出的產(chǎn)物均為結(jié)晶度在80%以上的BC 膜，不僅復(fù)水能力強(qiáng)且具有良好的張拉力學(xué)性能，與前人研究基本一致［17］。

4 結(jié)論

新會(huì)柑果汁的糖度為10.9%、pH 為3.9，酶解前后pH 保持一致但糖度均有所下降。單因素試驗(yàn)表明，以純柑汁為原料，在不添加檸檬酸且發(fā)酵時(shí)間15 d、pH 為6.0 的條件下得到的BC 產(chǎn)率相對(duì)最高。采用純柑汁、果膠酶解液、纖維素酶解液、纖維素酶+果膠酶解液生產(chǎn)BC 膜，通過復(fù)水性能測(cè)試、X 射線衍射和SEM 分析得出，4 種類型BC 膜的復(fù)水率均高于75%、結(jié)晶度均高于80%，但其微觀結(jié)構(gòu)存在較大差異，主要表現(xiàn)為BC 表面纖維的形態(tài)和結(jié)晶狀態(tài)的不同。本研究結(jié)果可為新會(huì)柑果汁生產(chǎn)BC提供技術(shù)支持，既能降低BC 的生產(chǎn)成本，同時(shí)也為新會(huì)柑的資源化開發(fā)提供思路。