同時測定肉制品中多種核苷酸的HPLC方法研究

李慧，張應杰，母運龍，錢琴，彭海川，張鵬程，張崟

(成都大學肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106)

5′-單核苷酸廣泛存在于蘑菇、水產品及畜禽肉中，目前發現的5′-單核苷酸主要有6種，包括肌苷-5′-單磷酸(5′-IMP)、鳥苷-5′-單磷酸(5′-GMP)、胞苷-5′-單磷酸(5′-CMP)、腺苷-5′-單磷酸(5′-AMP)、尿苷-5′-單磷酸(5′-UMP)、黃苷-5′-單磷酸(5′-XMP)。其中，5′-IMP、5′-GMP、5′-AMP、5′-XMP是增味核苷酸，具有良好的協同增鮮作用，將其與鮮味氨基酸按照一定比例混合可極大提升產品的鮮味，從而達到改善食品風味和調節食欲的效果。核苷酸對人體代謝具有積極意義，在配方奶粉中常添加多種核苷酸促進嬰兒生長發育。肉品中含有豐富的呈味核苷酸，不僅對增加肉品風味感知的厚度和復雜性具有重要貢獻，還可以評價肉制品品質及新鮮度。因此，測定肉類食品中5′-單核苷酸種類和含量對指導食品加工過程中的精準調控具有重要意義。

目前，國內外對核苷酸的測定方法主要有紫外分光光度法、毛細管電泳法、親水色譜法、離子色譜法和液相色譜法等。其中，以液相色譜法最為常見。目前已有用液相色譜法測定肉中核苷酸含量的相關研究，但主要是檢測原料肉中的5′-IMP、5′-GMP及其關聯產物的含量。王衛等用HPLC法建立了5′-IMP含量的測定方法，并通過不同選育豬肉對該方法進行了驗證；吳韜等運用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜檢測了牦牛肉中5′-IMP和5′-GMP的含量；唐修君等通過HPLC探討了冷藏和冷凍期間雞肉中5′-IMP、肌苷和次黃嘌呤含量變化，為解釋雞肉的風味損失提供了依據。但目前可同時檢測肉制品中多種5′-單核苷酸的研究較少，而且檢測成本高，為肉制品品質評價和控制帶來諸多不便。因此，本文擬建立可同時測定肉制品中多種5′-單核苷酸的測定方法，以期為快速高效地檢測肉制品中的核苷酸含量提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

冷鮮調理豬后腿(瘦肉)、調理豬里脊、風干牦牛肉、四川臘肉：均購于沃爾瑪超市。

1.2 主要試劑

核苷酸標準品：5′-GMP、5′-CMP、5′-UMP、5′-IMP、5′-AMP、5′-XMP，均為色譜純，購于美國Sigma公司。

甲醇：色譜純，賽默飛世爾科技有限公司。

氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、三氯乙酸：均為分析純，購于成都市科隆化學品有限公司。

1.3 儀器

Aglient 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Hypersil ODS2-C(4.6 mm×250 mm，5.0 μm) 大連依利特分析儀器有限公司；TGL-1650高速冷凍離心機 四川蜀科儀器有限公司；萬能粉碎機 IKA公司；pH計 上海儀天儀器股份有限公司；溶劑過濾器 天津津騰實驗設備有限公司；KQ3200DB數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.4 標準曲線

分別準確稱取6種核苷酸標準品各50.0 mg，用純水溶解后定容至50 mL，分別配制濃度為1 mg/mL的母液，分別量取不同體積的母液混合并稀釋成系列濃度，5′-IMP濃度范圍為4～200 μg/mL，5′-XMP濃度范圍為1.6～128 μg/mL，其他4種核苷酸濃度范圍為0.64～32 μg/mL。分別取不同濃度的混合核苷酸標準液10 μL上機測定，根據保留時間，以峰面積與所對應的核苷酸濃度作圖，并繪制標準曲線。

1.5 樣品的制備

以冷鮮調理豬后腿肉為原料，均勻取肉眼50 g，剁碎后置于液氮中冷凍10 min，利用超微粉碎機將其粉碎成粉，準確稱取20.00 g肉粉，置于50 mL塑料離心管中，加入TCA溶液，混勻，于4 ℃冰箱中放置2 h，取出后以5000 r/min的轉速離心10 min，將上清液轉入100 mL燒杯中，用3 mol/L的KOH溶液調pH至6.5，用定性濾紙過濾至50 mL容量瓶中，超純水定容搖勻，樣液過0.45 μm濾膜，用HPLC進樣分析，外標法定量，平行測定3次。

1.6 結果計算

樣品中核苷酸的計算公式如下：

式中：X表示樣品中核苷酸的含量，mg/g；C表示由標準曲線上查出的樣品測定液中相當于某種核苷酸的濃度，μg/mL；V表示樣品提取液的體積，mL；m表示樣品的質量，g。

1.7 色譜條件

采用Elite C色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動相A為純甲醇，流動相B為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，對樣品進行梯度洗脫(洗脫程序見表1)，柱溫：30 ℃，流速：0.8 mL/min，進樣量：10 μL。在此色譜條件的基礎上，對其他色譜參數進行優選。

表1 核苷酸測定梯度洗脫程序

1.8 滋味活性值(taste active value，TAV)

1.9 數據處理與分析

采用Excel軟件對數據進行處理，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優化

在核苷酸提取方法上，常用高氯酸作為核苷酸的提取劑，但是核苷酸在強酸性條件下不穩定。為優化核苷酸的提取方法，本文采用三氯乙酸(TCA)作為核苷酸的提取劑。TCA是食品檢測中常用的蛋白質沉淀劑，本實驗考察了不同濃度的TCA溶液(5%、10%、15%)沉淀肉中蛋白質的作用。結果發現3種濃度的TCA處理的樣品無明顯差異，溶液均出現分層，下層為白色沉淀，上清液近乎無色透明，無明顯絮狀懸浮物，靜置后穩定性好。

由于樣品中的核苷酸含量已經確定，而TCA溶液的主要作用是除雜和促進蛋白質沉淀，所以基于完全去除樣品中蛋白質的目的和檢測成本控制，選擇5%的TCA溶液作為蛋白質沉淀劑。基于5%的TCA溶液，本實驗還考察了添加不同體積的提取液對5′-單核苷酸測定的影響。由于豬肉中除5′-IMP和5′-XMP含量較高外，其他核苷酸含量均較低，過多的提取劑不利于檢測出所有核苷酸，因此最終確定5% TCA的添加量為40 mL。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 紫外檢測波長的優選

紫外吸收波長的選擇直接決定待測組分能否被儀器檢出，不同物質的紫外最大吸收波長不同，在最大吸收波長處測定可以盡量避免其他物質的干擾，因此合適的波長可直接衡量檢測方法的準確度和可靠性。通過紫外分光光譜掃描，得出6種核苷酸的特征光譜，見圖1。

圖1 6種5′-單核苷酸的掃描光譜圖

由圖1可知，5′-IMP、5′-GMP、5′-CMP、5′-AMP、5′-XMP、5′-UMP的最大吸收波長在248～260 nm之間。在該波長范圍內同時測定6種核苷酸，6種核苷酸均有紫外吸收，但每種核苷酸的吸收強度不同。通過比較不同波長下混合核苷酸的出峰情況，發現當檢測波長為250 nm時，6種核苷酸的信號值較大，各峰之間能很好分離，且峰形對稱。

2.2.2 流動相洗脫方法的優選

基于6種核苷酸之間的性質差異，本實驗分別使用了甲醇-磷酸二氫鉀溶液等度洗脫和梯度洗脫方法，結果表明，等度洗脫(甲醇濃度分別為5%、10%、15%、20%、50%)時，部分核苷酸色譜峰出現不同程度的拖尾和拓寬，相鄰的色譜峰之間交叉掩蓋，色譜峰分離度差。按表1進行梯度洗脫時，由圖2可知，在最佳紫外波長250 nm條件下，系統平衡快，基線穩定，標準品和樣品中6種核苷酸均能完全分離，樣品中待測組分與其他雜質峰分開，降低了雜質峰的干擾，分析時間短，峰形對稱。6種核苷酸標準品出峰順序和保留時間分別為5′-CMP: 4.992 min，5′-UMP: 5.793 min, 5′-GMP:7.945 min, 5′-IMP:8.423 min, 5′-XMP:9.148 min, 5′-AMP:14.287 min。調理豬肉樣品中核苷酸出峰順序和保留時間為5′-CMP:4.990 min，5′-UMP:5.843 min,5′-GMP:8.063 min, 5′-IMP:8.526 min, 5′-XMP:9.309 min, 5′-AMP:14.423 min，樣品和標準品中待測組分保留時間基本相同。

圖2 核苷酸標準品(a)和樣品(b)分離色譜圖(調理豬后腿制品)

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線

在1.7的液相色譜條件下，以不同濃度的混合核苷酸標準品溶液分別進樣，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。6種核苷酸標準曲線見圖3，回歸方程、相關系數、濃度范圍、樣品檢測限見表2。結果顯示，在一定濃度范圍內，6種核苷酸濃度和色譜峰面積之間相關性良好。

圖3 6種核苷酸標準品標準曲線

表2 各核苷酸回歸方程及相關系數

2.3.2 精密度

取同一調理豬后腿肉樣品，在1.7條件下連續進樣5次，結果見表3。

表3 精密度實驗

由表3可知，樣品中5′-CMP、5′-UMP、5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP和5′-AMP多次重復測定的相對標準偏差為1.08%、0.36%、3.35%、0.29%、1.78%和0.38%，表明該方法測定調理豬肉中的核苷酸具有較高的精密度。

2.3.3 重現性

取同一調理豬后腿肉樣品6份，按1.5操作制備供試樣液，再在1.7色譜條件下測定呈味核苷酸含量，結果見表4。6種核苷酸變異系數在0.40%～4.37%范圍內，表明該方法測定調理豬肉中的核苷酸具有較高的重復性(n=6)。

表4 重復性實驗

2.3.4 樣品穩定性

取同一調理豬后腿肉樣品，分別在放置1，3，6，10，13 h后測定6種核苷酸含量，結果見表5。實驗表明，樣品溶液在10 h內5′-CMP、5′-UMP、5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP、5′-AMP的RSD分別為4.42%、0.80%、6.35%、0.84%、2.99%、0.82%(n=3)，穩定性良好，因此，樣品制備后最好在10 h內完成測定。

表5 樣品穩定性實驗

2.3.5 加標回收率

在調理豬后腿肉樣品中分別準確加入不同含量的核苷酸標準混合液，各測定3次，計算回收率和變異系數，結果見表6。結果顯示，5′-CMP、5′-UMP、5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP、5′-AMP的回收率在89%～126%范圍內，變異系數在0.04%～2.21%之間，表明該方法測定調理豬肉中的核苷酸具有較高的精準度，可應用于肉制品中核苷酸的分析檢測。

表6 6種核苷酸加標回收率實驗

2.4 不同肉制品中核苷酸的種類及含量測定

通過本研究建立的方法，在3種肉制品中均檢測出6種5′-單核苷酸。由表7可知，調理豬里脊中5′-IMP含量最高，其他5種核苷酸含量均較低，5′-IMP對調理豬里脊滋味貢獻最大，這與趙艷等的研究結果相同。風干牦牛肉相比于其他兩種肉制品5′-IMP、5′-GMP、5′-AMP含量均較高，這可能是形成風干牦牛肉特殊滋味的重要原因。5′-UMP在風干牦牛肉和四川臘肉中含量均最高，這可能與其特殊的加工工藝有關，5′-UMP本身無增味的功效，但具有維持免疫系統功能、促進腸道成熟等作用。

表7 不同肉制品中核苷酸的測定

2.5 鮮味評價

水溶性成分造就了肉制品復雜的滋味，通常用呈味強度值(taste activity value,TAV)考察物質對滋味的貢獻大小。當TAV大于1時，表明該物質對肉制品的整體滋味有重要貢獻，值越大貢獻越大，反之則影響不大。5′-GMP、5′-IMP、5′-AMP是典型的增味核苷酸，其閾值及TAV見表8。

表8 不同肉制品中滋味活性物質的呈味強度

由表8可知，3種肉制品中，調理豬里脊和風干牦牛肉中5′-IMP的TAV>1，5′-GMP和5′-AMP的TAV<1，說明5′-IMP對調理豬里脊和風干牦牛肉的滋味具有重要貢獻，而5′-GMP和5′-AMP對滋味的貢獻較小；呈味核苷酸對四川臘肉滋味的貢獻不明顯，其風味主要來源于揮發性成分、粗蛋白、脂肪酸及氨基酸等物質。

3 結論

本實驗建立了可同時測定6種5′-單核苷酸的HPLC方法，具體色譜條件：C色譜柱，以甲醇(2%～15%)和0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(98%～85%)為流動相進行梯度洗脫，紫外檢測波長250 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。在該檢測條件下，6種5′-單核苷酸均能較好分離，線性相關系數均大于0.99。通過將該方法用于冷鮮調理豬肉進行驗證，發現其中的6種5′-單核苷酸均能一次性檢出，每種5′-單核苷酸的加標回收率在89%～126%之間，RSD值在0.04%～2.21%之間。方法學驗證結果表明，該方法操作便捷，準確度高，重現性好，能用于肉制品中核苷酸含量的測定。