寵物食品中維生素B12的快速測(cè)定

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（1.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)（青島）有限公司，山東青島 266071；2.北京美正生物科技有限公司，北京 102200）

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國的寵物行業(yè)快速崛起，寵物食品的需求量也日益增加，近十年我國寵物食品的平均增長(zhǎng)率為25%[1]。寵物食品指的是根據(jù)寵物的整個(gè)生理周期、寵物的品種和需要的營養(yǎng)而專門為寵物研發(fā)的營養(yǎng)均衡的食品[2]。目前，狗糧和貓糧是最具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值、規(guī)模和市場(chǎng)運(yùn)作能力的主要寵物食品[3]。根據(jù)形態(tài)不同，可以將寵物食品分為干性寵物食品、濕性寵物食品和半干性寵物食品三大類[4]。我國寵物食品行業(yè)起步較晚，寵物營養(yǎng)管理方面的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)并不完善。目前，行業(yè)內(nèi)公認(rèn)的三大營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)包括美國飼料管理協(xié)會(huì)、美國國家研究委員會(huì)以及歐盟飼料行業(yè)協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)[5]。國內(nèi)企業(yè)為滿足消費(fèi)者的需要及出口需求，寵物食品中的營養(yǎng)成分會(huì)按照相應(yīng)的美國飼料管理協(xié)會(huì)或歐盟飼料行業(yè)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行添加。

維生素B12（鈷胺素）是一種重要的維生素，在保持寵物健康方面發(fā)揮著一些特殊作用。維生素B12對(duì)于維持神經(jīng)系統(tǒng)和細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要，同時(shí)在造血、改善大腦功能和維持良好的腸道健康方面也起著關(guān)鍵作用[6]。目前，對(duì)于維生素B12的檢測(cè)主要集中于功能飲料[7]、保健食品[8]、配方奶粉[9]和血清[10]等領(lǐng)域，對(duì)于寵物食品中的維生素B12的檢測(cè)鮮有報(bào)道。根據(jù)美國飼料管理協(xié)會(huì)的要求，犬糧中維生素B12的最低含量為2.8 μg/100 g，貓糧中維生素B12的最低含量為2.0 μg/100 g[5]。而歐盟飼料行業(yè)協(xié)會(huì)中規(guī)定，維生素B12在生長(zhǎng)和繁育期犬糧和貓糧中的含量不得低于2.8 μg/100 g和1.8 μg/100 g，在成年期犬糧和貓糧中不得低于3.87 μg/100 g和2.35 μg/100 g。維生素B12的常用檢測(cè)方法包括HPLC法、HPLCMS法、酶聯(lián)免疫法和微生物法[11]，由于寵物食品的基質(zhì)復(fù)雜且維生素B12的含量較低，微生物法是較為合適的選擇，該方法雖然靈敏度較高，但由于操作煩瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，重復(fù)性差而不能被廣泛應(yīng)用。本研究擬對(duì)維生素B12的微生物測(cè)定法進(jìn)行優(yōu)化，將試管法改進(jìn)為96孔微孔板法，對(duì)寵物食品中維生素B12的測(cè)定進(jìn)行相關(guān)評(píng)價(jià)試驗(yàn)，以期為寵物食品中維生素B12的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AL204-IC電子天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；VORTEX3渦旋振蕩器，德國IKA；HWS-28電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DL-CJ-2ND潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；ELX808酶標(biāo)儀，美國BioTek；維生素B12檢測(cè)試劑盒，北京美正生物科技有限公司；萊士曼氏乳酸桿菌，美國典型菌種保藏中心，ATCC7830；維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH。

1.2 試驗(yàn)用樣品的制備

選取9份不含有維生素B12的寵物食品樣品，包括3份全價(jià)貓糧基底、3份全價(jià)犬糧基底和3份成貓主食罐基底。人工添加維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品至9批樣品中，使維生素B12含量分別為1.0 μg/100 g、5.0 μg/100 g 和 10.0 μg/100 g。

1.3 樣品的前處理

稱取1.0 g均質(zhì)后的樣品，將其加入50 mL無菌離心管中，加入40 mL去離子水，在95 ℃水浴中提取30 min，每隔10 min混勻1次（確保離心管密封），然后快速冷卻至30 ℃以下。用0.22 μm無菌濾膜過濾取濾液。根據(jù)維生素B12的濃度范圍，在2 mL無菌離心管中使用無菌水對(duì)濾液進(jìn)一步稀釋。

1.4 微孔板法檢測(cè)

1.4.1 配制維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品

打開標(biāo)準(zhǔn)品瓶蓋，取2.8 mL無菌水加入標(biāo)準(zhǔn)品瓶中，蓋上瓶蓋，振蕩使標(biāo)準(zhǔn)品充分溶解，即為標(biāo)準(zhǔn)品工作液。取6個(gè)2 mL無菌離心管，將標(biāo)準(zhǔn)品工作液分別稀釋成 0 μg/100 g、0.03 μg/100 g、0.06 μg/100 g、0.09 μg/100 g、0.12 μg/100 g 和0.18 μg/100 g。

1.4.2 檢測(cè)菌液的制備

向維生素B12培養(yǎng)基瓶中加入10 mL無菌水，蓋緊瓶蓋，振蕩溶解。保證瓶蓋密閉的前提下，95 ℃水浴加熱5 min，然后快速冷卻至室溫（低于30 ℃）。使用0.22 μm無菌濾膜過濾全部培養(yǎng)基，用15 mL無菌離心管收集全部濾液。向凍干菌株瓶?jī)?nèi)加入1 mL無菌水，用移液槍吹打混勻，取其中的0.9 mL加入過濾后的培養(yǎng)基中，振蕩混勻，即為檢測(cè)菌液。

1.4.3 檢測(cè)步驟

取出所需數(shù)量的微孔條置于微孔架上，依次將140 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、140 μL檢測(cè)菌液加入微孔中，然后用粘膠薄膜蓋好微孔條，在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育44～48 h。培養(yǎng)完成后，輕輕來回顛倒混勻微孔板，使菌液充分混勻，然后用一只手將微孔條固定于微孔架上，另一只手自右上方沿對(duì)角揭開粘膠薄膜，靜置2 min待氣泡全部消去后用酶標(biāo)儀在610～630 nm下測(cè)量渾濁度，使用四參數(shù)法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。

1.5 微生物法與微孔板法的比較

分別使用國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測(cè)定》（GB 5413.14—2010）與微孔板法對(duì)表1中所列9種寵物食品中的維生素B12進(jìn)行測(cè)定，將這兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較研究，包括回收率分析及線性分析。

1.6 寵物食品樣品檢測(cè)

寵物食品分為濕糧和干糧兩大類，根據(jù)產(chǎn)品形態(tài)不同，干糧可分為高溫膨化糧、低溫烘焙糧、凍干糧和風(fēng)干糧等，濕糧可分為罐頭和鮮食等。據(jù)此，選擇各品類共37個(gè)樣品，分別使用微孔板法與微生物法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加標(biāo)試驗(yàn)回收率分析

分別使用微孔板法和微生物法對(duì)表1所列9份寵物食品樣品進(jìn)行維生素B12的測(cè)定，計(jì)算各濃度水平的回收率，結(jié)果見表1。微生物法的回收率為94.0%～106.0%，而微孔板法的回收率稍低于微生物法，為93.0%～97.0%，回收率均能達(dá)到90%以上。

表1 寵物食品維生素B12加標(biāo)回收率

2.2 自然樣品的檢測(cè)結(jié)果

選擇各品類共37個(gè)樣品，分別使用微孔板法與微生物法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2。對(duì)兩種方法的結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析，單因素方差分析結(jié)果顯示F＜Fcrit，表明在各品類寵物食品中，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)100%，均無顯著性差異。

表2 兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

目前，微生物法是美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)和美國藥典檢測(cè)維生素B12的首選方法，但該方法操作煩瑣，影響結(jié)果的因素多，對(duì)測(cè)試人員的要求高。微孔板法的原理與微生物法基本一致，但極大程度上簡(jiǎn)化了操作流程，減少了菌種在保存?zhèn)鞔邪l(fā)生污染可能性，數(shù)據(jù)處理操作簡(jiǎn)便。針對(duì)寵物食品特殊基質(zhì)，進(jìn)一步優(yōu)化了提取流程，縮短檢驗(yàn)周期，同時(shí)也減少了試驗(yàn)過程中因操作步驟煩瑣引起的誤差，與微生物法相比，具備良好的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。

寵物食品主糧產(chǎn)品分為干糧和濕糧兩類。干糧主要特征是水分含量少、表面干燥、顆粒狀，包括膨化糧、烘焙糧、風(fēng)干糧和凍干糧等多種產(chǎn)品形態(tài)。濕糧主要是糊狀、水分含量高，主要有罐頭和鮮食兩種形態(tài)。徐坤等[12]研究發(fā)現(xiàn)，寵物食品在擠壓膨化、制粒及貯存過程中，各種維生素隨著溫度或時(shí)間的變化都有一定程度的損失。經(jīng)擠壓加工后，寵物食品中脂類的氧化作用產(chǎn)生的氫過氧化物、過氧化物和環(huán)過氧化物等會(huì)引起維生素A、E等的氧化產(chǎn)生過氧化物，與活性的羰基反應(yīng)造成維生素B6等的破壞，糖類非酶褐變產(chǎn)生的高度活化的羰基對(duì)維生素同樣具有破壞作用。王紅英等[13]以維生素C為例，對(duì)制粒過程中的調(diào)質(zhì)溫度、蒸汽壓力、喂料器的給料速度等因素進(jìn)行了試驗(yàn)研究，提出了影響維生素穩(wěn)定性的主要因素是調(diào)質(zhì)溫度和蒸汽壓力。葛建東等[14]也發(fā)現(xiàn)在制粒時(shí)調(diào)質(zhì)用的蒸汽、高溫以及擠壓所造成的摩擦都是破壞維生素的主要因素。膨化的調(diào)質(zhì)溫度和壓力都高于制粒，破壞性更大，膨化時(shí)加入大量的水分也是一個(gè)重要影響因素。本研究測(cè)試了主要品類的貓糧及犬糧中的維生素B12，結(jié)果表明，維生素B12在凍干貓糧中的平均含量最高，達(dá)到16.0 μg/100 g，而在高溫膨化糧中的平均含量最低，僅為6.2 μg/100 g。需要說明的是，寵物罐頭及鮮食雖然維生素B12的平均含量更低，但由于其含水量高達(dá)70%～90%，因此折算干基后維生素B12含量更高。

隨著養(yǎng)寵滲透率的提升，并受益于寵物主對(duì)科學(xué)喂養(yǎng)理念的科普與產(chǎn)品認(rèn)知的提高，越來越多的養(yǎng)寵人逐漸重視寵物的營養(yǎng)健康，國產(chǎn)寵物食品企業(yè)正在快速進(jìn)階，相關(guān)部門也應(yīng)當(dāng)加大監(jiān)管力度，并制定相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)，促進(jìn)我國寵物食品行業(yè)健康發(fā)展。