液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法法測定禽畜肉中氯霉素類獸藥殘留量

王文鵬，王 濤，王娜娜，李 麗

（延安市食品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，陜西延安 716000）

酰胺醇類抗生素主要有氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考，其中氯霉素是其代表性藥物，因此也常被稱為氯霉素類抗生素。氯霉素對多數(shù)革蘭陰性菌和革蘭陽性菌都有抑制作用，抗菌譜廣，價格相對低廉，常被用于禽畜產(chǎn)品、水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過程中[1]。但由于其嚴重的毒副作用，近年來美國、歐盟及中國等已禁止應用于動物疾病防治，規(guī)定在動物源性食品中不得檢出[2]。而其同類物甲砜霉素、氟苯尼考在《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中都有規(guī)定，其中甲砜霉素的ADI為 0～ 5 μg·kg-1，在牛、羊、豬、家禽和魚的各種可食組織中最大殘留量為50 μg·kg-1；氟苯尼考的 ADI為 0 ～ 3 μg·kg-1，在牛、羊的肌肉組織中最大殘留量為200 μg·kg-1，在其肝臟組織中為3 000 μg·kg-1，在其他動物食品的不同組織中各有不同。氟苯尼考胺作為氟苯尼考主要的代謝產(chǎn)物，其最大殘留量要計入氟苯尼考[3]。但目前其檢測標準不同，且同時測定食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的方法較少[4-6]。本文參考相關標準和文獻建立了一種同時測定4種酰氨醇類抗生素的方法[7-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

豬肉、雞肉、牛肉，采購自市場。取肌肉組織將其切碎，充分混勻，直接放入組織搗碎機中搗碎成勻漿，放入聚乙烯瓶中，-18 ℃冷凍保存。

1.2 試劑

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺和氯霉素 -D5（100 μg·mL-1）（由壇墨質(zhì)檢提供）；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨（色譜純，默克試劑）；無水硫酸鎂、無水乙酸鈉（分析純，國藥試劑）；所用氮氣、氬氣濃度大于99.99%。

1.3 儀器與設備

LCMS8040三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI源），日本島津；離心機：轉(zhuǎn)速≥10 000 r·min-1，Sigama；渦旋混合器：IKA；電子天平（感量為0.001 g）：梅特勒；氮吹濃縮儀：萊伯泰科；具塞離心管：50 mL和15 mL，康寧。

1.4 試樣的制備及方法

1.4.1 試樣制備

稱取解凍后試樣5 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加 100 μL 氯霉素 -D5 內(nèi)標（0.1 μg·mL-1）工作液和15 mL 2%氨水乙腈溶液，渦旋振蕩15 min，超聲提取 15 min，8 000 r·min-1離心 5 min。將上清液移入100 mL分液漏斗中，加15 mL乙腈飽和的正己烷脫脂。殘渣中再加入10 mL 2%氨水乙腈溶液，重復一次，取上清液轉(zhuǎn)移至同一分液漏斗。轉(zhuǎn)移乙腈層至50 mL離心管中，離心，取上層清液，氮氣吹干。加入1 mL水，振蕩2 min，超聲3 min復溶，取下層過0.22 μm微孔濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。空白基質(zhì)的制備與樣品制備過程相同。

1.4.2 標準溶液的配制

分別精密量取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺 4 種標準溶液（100 μg·mL-1）各 0.2 mL，置于同一20 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度均為1 μg·mL-1的混合標準中間液，精密量取1 mL內(nèi)標中間液于10 mL容量瓶，用甲醇稀釋成100 ng·mL-1的混合標準使用液。

精密量取氯霉素 -D5 標準溶液（100 μg·mL-1）0.2 mL，置于另一20 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度均為1 μg·mL-1的內(nèi)標中間液，精密量取1 mL內(nèi)標中間液于10 mL容量瓶，用甲醇稀釋成100 ng·mL-1的內(nèi)標使用液。

取空白樣品9份，按照1.4.1的處理過程，在氮氣吹干之前加入適量標準使用液和100 μL氯霉素-D5內(nèi)標（100 ng·mL-1），用1 mL 10%甲醇水復溶，制成 0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和 200.0 ng·mL-1系列濃度，含內(nèi)標 10.0 ng·mL-1。

1.5 儀器條件

1.5.1 參考液相色譜條件

色譜柱：C18柱[150 mm×2.1 mm（內(nèi)徑），1.7 μm]，菲羅門（Phenomenex）；流動相：A-甲醇；B-水溶液；梯度洗脫程序見表1；柱溫箱：40 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.30 mL·min-1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），其中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素-D5為負模式，氟苯尼考胺為正模式；離子源接口電壓：4.5 kV；霧化氣：氮氣 2.0 L·min-1；干燥氣：氮氣 15 L·min-1；碰撞氣：氬氣；DL溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；掃描模式：多反應監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；駐留時間：100 ms；延遲時間：3 ms。MRM參數(shù)見表2。

表2 4種氯霉素類藥物和內(nèi)標化合物的保留時間、定量離子對、定性離子對

2 結(jié)果與分析

2.1 條件優(yōu)化與選擇

動物源食品中氯霉素的檢測，主要有氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜兩種檢測方法，文獻中同時檢測氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺多種藥物的方法一般是液相色譜-質(zhì)譜法，大部分是檢測其中2～3種[4-6]。通過測試，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺需要用內(nèi)標法定量，因其樣品的制備過程中損失較多，這與文獻報道基本一致[7-9]。本研究比較了乙酸乙酯和乙腈等多種提取手段，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取脂肪較多，而2%氨水乙腈提取效果較好，能滿足實驗要求。文獻中常用流動相為乙腈-水體系或甲醇-水體系[9-10]，也有添加氨水的文獻報道[7]，經(jīng)過測試，甲醇和水的體系就能達到較好的分離效果，因此本文選用甲醇-水體系，和現(xiàn)行有效國家標準一致。

2.2 線性關系與檢出限

以各組分的定量離子峰面積與氯霉素-D5內(nèi)標峰面積的比例為縱坐標（y），相應的質(zhì)量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，繪制標準曲線。結(jié)果表明，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在0.5～200.0 ng·mL-1有良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.995，線性方程和相關系數(shù)見表3。取牛肉陰性樣品，添加0.1 mg·kg-1混合標準溶液，加入標準混合液，以3倍信噪比法計算的檢出限在0.022～0.120 μg·kg-1。

表3 4種氯霉素類藥物的線性關系

2.3 加標回收率和重復性

取牛肉陰性樣品，添加 0.1 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-13個濃度水平的混合標準溶液，進行加標回收試驗，其余操作同1.4.1樣品制備，每個濃度平均測定6次，計算回收率和重現(xiàn)性（以相對標準偏差表示）。結(jié)果顯示，樣品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的平均回收率在88.45%～112.45%，相對標準偏差RSD為1.86%～8.04%，具體結(jié)果見表4。結(jié)果表明,該方法回收率高、穩(wěn)定性好，適用于牛肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的測定。同時對豬肉和雞肉測試，得到相似的結(jié)論。

表4 3個添加水平上回收率和相對標準偏差

3 結(jié)論

本研究通過對牛肉、雞肉和豬肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的分析測試，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定食品中禽畜肉中4種氯霉素類藥物殘留的方法，并從線性關系、回收率、重復性和檢出限等方面進行了考察。結(jié)果表明，該方法快捷、簡便、回收率高，可用于禽畜肉中4種氯霉素類藥物及其代謝物的測定，為研究同時測定動物源性食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的殘留提供了參考依據(jù)。