高效液相色譜法測(cè)定蜂蜜中諾氟沙星殘留

魏超田，高倩妮

（1.安徽正鑒檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，安徽亳州 236800；2.安徽萬花草生物科技有限公司，安徽亳州 236800；3.亳州學(xué)院，安徽亳州 236800）

隨著人們對(duì)健康和天然保健產(chǎn)品的追求和崇尚，具有抗氧化性、抗菌性等生物活性功能的蜂蜜及其產(chǎn)品的質(zhì)量受到了人們的廣泛關(guān)注。蜂蜜在養(yǎng)殖過程中會(huì)感染疾病或受到蟲害，峰農(nóng)為控制病蟲害的發(fā)生而濫用抗生素，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留問題的發(fā)生。諾氟沙星屬喹諾酮類藥物，是在喹諾酮母核的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工合成的一類廣譜抗菌藥，因其價(jià)格低、抗菌性強(qiáng)，被廣泛用于人和動(dòng)物疾病的治療[1]。但其自身無法分解，在人體內(nèi)會(huì)大量積累殘留，人們食用動(dòng)物組織后可能出現(xiàn)對(duì)該藥物的嚴(yán)重耐藥性。諾氟沙星在蜂蜜養(yǎng)殖過程中屬于禁用藥物，一經(jīng)檢出即為不合格產(chǎn)品[2]。2019年國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局對(duì)蜂蜜抽檢項(xiàng)目中，新增了幾項(xiàng)喹諾酮類，其中諾氟沙星殘留就是其中一項(xiàng)[3]。

目前測(cè)定諾氟沙星殘留量的方法有微生物法、高效液相色譜-紫外或二極管陣列檢測(cè)[4-6]、薄層色譜法[7-9]以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）)[10-13]。其中質(zhì)譜法運(yùn)用較多，質(zhì)譜法雖然檢出限低但操作復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，且由于設(shè)備條件和成本的限制無法普及。相關(guān)學(xué)者對(duì)諾氟沙星藥物殘留的檢測(cè)方法研究大多集中在畜產(chǎn)品、奶制品、水產(chǎn)品上[14-16]，對(duì)于蜂蜜中的諾氟沙星殘留檢測(cè)較少，且動(dòng)物性等產(chǎn)品的前處理方法不適用蜂蜜。本試驗(yàn)通過研究蜂蜜不同的前處理方式，建立了一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效、實(shí)用性強(qiáng)的高效液相色譜法測(cè)定蜂蜜中的諾氟沙星，以期為快速檢測(cè)蜂蜜中諾氟沙星含量奠定理論基礎(chǔ)，為蜂產(chǎn)品質(zhì)量控制提供相應(yīng)保證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)樣品；乙腈（色譜純），甲酸、乙酸、氫氧化鈉、無水硫酸鎂、磷酸氫二鈉以及磷酸氫二鉀均為分析純，國藥基團(tuán)；蜂蜜（5種不同品牌）購自超市。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（配有紫外、熒光檢測(cè)器），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；AcclaimTMPolarAdvantage Ⅱ C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確量取 100 μg·mL-1的諾氟沙星標(biāo)液 10 μL，用0.2%甲酸水溶液定容至1 mL，配制成1.00 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取儲(chǔ)備液按梯度稀釋配制成濃度為 0.001 μg·mL-1、0.002 μg·mL-1、0.004 μg·mL-1、0.080 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1和 0.200 μg·mL-1的 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，儲(chǔ)備于冰箱中備用。

1.3.2 高效液相色譜條件

色 譜 柱：AcclaimTMPolarAdvantage Ⅱ C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.5 mL·min-1；進(jìn)樣量 10 μL；流動(dòng)相：流動(dòng)相 A（乙腈）∶流動(dòng)相B（0.2%甲酸水溶液）為13∶87（體積比，下同）。

1.3.3 蜂蜜樣品處理

（1）蜂蜜稀釋液的選擇。①先用水溶解樣品，再用0.5%乙酸的乙腈溶液萃取蜂蜜中的諾氟沙星。②用0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液溶解樣品，再用0.5%乙酸的乙腈溶液萃取蜂蜜中的諾氟沙星。③用Mallvaine pH 4.0緩沖液溶解樣品，再用0.5%乙酸的乙腈溶液提取，最后水浴蒸發(fā)濃縮提取諾氟沙星。

稱取約5.00 g（精確到0.01）蜂蜜，加入5.0 mL 0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液，攪拌均勻，加入25 mL 0.5%乙酸乙腈溶液，渦旋5 min，加入無水硫酸鎂5 g，渦旋2 min，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液。

固相萃取柱依次用甲醇、磷酸緩沖鹽各2 mL預(yù)淋，取上清液過柱，10 mL甲醇洗脫，收集液水浴蒸至近干，0.2%乙酸水溶液溶解定容至2 mL，過0.45 μm有機(jī)濾膜，高效液相色譜儀分析測(cè)定。

（2）提取液的選擇。選取0.05 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液、0.5%乙酸的乙腈溶液、乙腈+水（8∶2）混合溶液為蜂蜜中諾氟沙星的提取液，考察不同提取液及其添加量對(duì)蜂蜜中諾氟沙星提取量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜方法的建立

2.1.1 流動(dòng)相及其比例的確定

目前高效液相色譜法測(cè)定喹酮類含量時(shí)，一般選擇磷酸/三乙胺、磷酸/庚烷磺酸鈉、磷酸/四丁基溴化銨體系作為流動(dòng)相分離喹諾酮類，但這幾種體系中都含有鹽類物質(zhì)，易結(jié)晶，測(cè)定中容易造成色譜柱和檢測(cè)器堵塞，極大縮短了色譜柱的使用壽命。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)熒光檢測(cè)器對(duì)含有乙腈的流動(dòng)相變化較敏感，且在流動(dòng)相中加入適量的甲酸可以提高其靈敏度，因此本試驗(yàn)在乙腈-0.2%甲酸，0.05 mol·L-1磷酸溶液/三乙胺-乙腈兩種系列作為流動(dòng)相的情況下測(cè)定諾氟沙星，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.05 mol·L-1磷酸溶液/三乙胺-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，諾氟沙星出峰時(shí)間為12.377 min，且基線不穩(wěn)定；0.2%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，諾氟沙星出峰時(shí)間為8.533 min，極大地節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間，且響應(yīng)值較高，基線穩(wěn)定，鋒型更加對(duì)稱尖銳，分離效果較好，信噪比更高。具體見圖1、圖2。此外，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，熒光檢測(cè)器對(duì)于甲酸與乙腈比例的變化較為敏感，梯度洗脫時(shí)引起的基線漂移較為明顯，本文最終選擇0.2%甲酸水溶液-乙腈（87∶13）作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，洗脫時(shí)間18 min。此條件溫和，不會(huì)損傷色譜柱，同時(shí)能夠有效分離得到較好峰形，易控制。

圖1 流動(dòng)相為0.05 mol·L-1磷酸鹽/三乙胺-乙腈時(shí)的色譜圖

圖2 流動(dòng)相為0.2%甲酸水溶液/乙腈時(shí)的色譜圖

2.1.2 流速優(yōu)化

不同的色譜柱對(duì)同一樣品有不同的保留時(shí)間，同一物質(zhì)其出峰時(shí)間受流速的影響極大。一般情況下，流速由色譜柱的內(nèi)徑大小直接決定，內(nèi)徑越大流速則相對(duì)較大，樣品分析時(shí)間也會(huì)相對(duì)較短，所以提高流速可大大縮短樣品分析時(shí)間，但樣品在色譜柱中的流速過大則會(huì)在一定程度上影響其分離效果，引起基線漂移。本試驗(yàn)選擇 1.2 mL·min-1、1.5 mL·min-1、1.8 mL·min-13種不同流速，觀察流速對(duì)分離時(shí)間、基線和分離度的影響，結(jié)果見圖3、圖4和圖5。

圖3 流速為1.2 mL·min-1時(shí)的色譜圖

圖4 流速為1.5 mL·min-1時(shí)的色譜圖

圖5 流速為1.8 mL·min-1時(shí)的色譜圖

隨著流速的增加，目標(biāo)物出峰時(shí)間逐漸縮短，流速為1.8 mL·min-1時(shí)，出峰時(shí)間為7.285 min，峰圖有稍微拖尾的現(xiàn)象，出峰前基線不穩(wěn)現(xiàn)象明顯；當(dāng)流速為1.2 mL·min-1，出峰時(shí)間為10.643 min，目標(biāo)物后含有小峰；流速為1.5 mL·min-1時(shí)出峰時(shí)間為8.530 min，峰圖無拖尾現(xiàn)象且峰形較為尖銳對(duì)稱，相對(duì)流速為1.8 mL·min-1的譜圖，其基線更穩(wěn)定，峰圖效果好，相對(duì)流速為1.2 mL·min-1的譜圖，其出峰時(shí)間有所縮短，峰圖效果好，因此本試驗(yàn)研究最終選擇流速為 1.5 mL·min-1。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 方法初確定

（1）稀釋液的選擇。蜂蜜是一種特殊物質(zhì)，黏稠度較大，很難均勻分散，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)如果直接向蜂蜜中加入提取液乙腈，會(huì)使蜂蜜變成膠狀物。有研究表明，氫氧化鈉溶液有助于蜂蜜的溶解[17]。因此本試驗(yàn)選擇水、Mallvaine pH 4.0緩沖液和0.02 mol·L-1氫氧化鈉3種稀釋液，在提取之前將蜂蜜樣品制備成均勻相體系，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)等量添加水、Mallvaine pH 4.0緩沖液時(shí)，蜂蜜不易溶解分散，而同比例的0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液可以很好地將蜂蜜溶解使其成為分散性體系，且分離程度高，色譜圖效果好，因此選擇1.3.3中方法2進(jìn)行蜂蜜稀釋液制備，即選取0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液作為蜂蜜樣品中稀釋液。

（2）提取液的選擇。選取0.05 mol·L-1L磷酸緩沖鹽溶液、0.5%乙酸的乙腈溶液、乙腈+水（8∶2）混合溶液作為蜂蜜中諾氟沙星的提取液。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，同體積添加的3種提取液所提取的諾氟沙星含量分別為 0 ng·g-1、1.181 3 ng·g-1、1.151 9 ng·g-1，可見0.5%乙酸的乙腈溶液提取效果最好，因此初選取0.5%乙酸的乙腈溶液作為蜂蜜稀釋液中諾氟沙星的提取液。具體見圖6～圖9。

圖6 空白蜂蜜樣品色譜圖

圖7 磷酸鹽緩沖液為提取液時(shí)的陽性樣品色譜圖

圖8 0.5%乙酸的乙腈溶液為提取液時(shí)的陽性樣品色譜圖

圖9 乙腈+水（8∶2）混合溶液為提取液時(shí)的陽性樣品色譜圖

2.2.2 方法的進(jìn)一步確定與優(yōu)化

在大量的預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，樣品稀釋液的添加量和提取時(shí)加入0.5%乙酸的乙腈溶液的量對(duì)諾氟沙星的提取濃度有明顯影響，本文利用2因素3水平試驗(yàn)，研究這2個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果分析如表1所示。

由表1可知，當(dāng)蜂蜜∶0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液=1∶1，蜂蜜∶0.5%乙酸的乙腈溶液=1∶5時(shí)，諾氟沙星提取效果最佳，提取量為1.349 6 ng·g-1。

表1 不同添加量的氫氧化鈉和乙酸乙腈溶液對(duì)諾氟沙星提取濃度的影響（單位：ng·g-1)

2.2.3 重復(fù)性驗(yàn)證

當(dāng)蜂蜜∶0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液=1∶1，蜂蜜∶0.5%乙酸的乙腈溶液=1∶5時(shí)，添加不同濃度諾氟沙星，驗(yàn)證蜂蜜中諾氟沙星的重復(fù)性驗(yàn)證，結(jié)果分析如表2所示。選擇含3.00 ng·mL-1、8.70 ng·mL-1諾氟沙星的蜂蜜樣品，經(jīng)測(cè)試精密度變異系數(shù)均不超過10%。

表2 不同添加量的諾氟沙星重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

將諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)液逐步稀釋，配制成濃度為0.001 μg·mL-1、0.002 μg·mL-1、0.004 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1和 0.200 μg·mL-1標(biāo) 準(zhǔn) 工 作 液， 以 目標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)（Y）對(duì)進(jìn)樣濃度（X）進(jìn)行線性擬合，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=162 611 326.87X-422 884.11，在 0.001 ～ 0.200 μg·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.995 7。

2.3.2 精密度與檢出限

精密吸取標(biāo)液0.003 μg·mL-1，平行測(cè)定6次，得到各組分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.72%。在空白蜂蜜基質(zhì)中添加0.4 μg·kg-1諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，諾氟沙星藥物的信噪比（S/N)大于10，表明該方法諾氟沙星藥物的方法檢出限可達(dá)到0.4 μg·kg-1，滿足分析要求。

2.3.3 加標(biāo)試驗(yàn)

向5 g蜂蜜空白樣中添加濃度分別為0.03 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1的 諾 氟 沙 星 標(biāo) 液 各100 μL進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)3次。諾氟沙星回收率結(jié)果見表3。其回收率為84.98%～105.72%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.84%～2.94%，滿足線性分析要求。

表3 蜂蜜中添加不同濃度標(biāo)樣所測(cè)回收率

2.3.4 蜂蜜產(chǎn)品檢測(cè)

為了將方法應(yīng)用于市場(chǎng)，對(duì)市場(chǎng)上的蜂蜜樣品任選3個(gè)種類、5種不同品牌進(jìn)行檢測(cè)，分別為椴樹蜂蜜、洋槐蜂蜜及老蜂蜜共抽檢了5份，均未檢出諾氟沙星，符合我國規(guī)定蜂蜜中諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)值（不得檢出），差異不顯著。

3 結(jié)論

本文對(duì)市場(chǎng)上的蜂蜜樣品任選3個(gè)種類、5種不同品牌進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出諾氟沙星，符合我國規(guī)定蜂蜜中諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)值（不得檢出），差異不顯著。以乙腈-2%甲酸水溶液（13∶87）為流動(dòng)相，流速為1.5 min·L-1，柱溫35 ℃，熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm為優(yōu)化后的色譜條件；以0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液（與蜂蜜的比例為1∶1）溶解蜂蜜，制作成蜂蜜溶液，然后用0.5%乙酸的乙腈溶液與蜂蜜水溶液（5∶1）萃取諾氟沙星，過固相萃取柱氮?dú)獯蹈桑僖砸译嫒芙鉃閮?yōu)化后的前處理方法，采用高效液相色譜法-熒光檢測(cè)器檢測(cè)蜂蜜中的諾氟沙星藥物殘留量。結(jié)果表明，該方法的檢出 限 為 0.4 μg·kg-1， 在 0.001 ～ 0.200 μg·mL-1呈 良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 7，加標(biāo)回收率為84.98%～105.72%，利用該方法通過檢測(cè)不同品牌生產(chǎn)的蜂蜜，結(jié)果均未檢出諾氟沙星，進(jìn)一步驗(yàn)證本方法能夠滿足殘留分析的要求，為蜂蜜中諾氟沙星殘留量測(cè)定提供了一種簡(jiǎn)便快捷準(zhǔn)確的色譜方法，為蜂產(chǎn)業(yè)的安全生產(chǎn)提供了保障。