響應面法優化刺梨果總多酚提取工藝

劉 丹，江 帆，趙 麗，安崇惠

（1.貴州省食品藥品檢驗所，貴州貴陽 550004；2.貴州師范大學，貴州貴陽 550001；3.貴陽青青生物科技有限公司，貴州貴陽 550001）

近年來，通過對刺梨果化學成分的研究發現，刺梨果中含有多種生物活性成分，如多酚類、黃酮類、氨基酸和維生素等[1-7]。

刺梨多酚是從刺梨果實中發現的生物活性成分之一，研究證明其是刺梨果中主要的抗氧化活性物質之一[8-9]。目前提取多酚的方法主要是超聲波輔助提取，該方法具有縮短提取時間、減少溶劑消耗的優點。此外，超聲波輔助提取可以避免熱損傷和減少生物活性物質的損耗并適合在較低的溫度下使用[10]。在提取過程中，提取率受多個獨立的變量影響。因此，優化刺梨多酚的提取方法是必要的。響應面法是統計和數學技術的有效集合，它可以很好地開發和優化復雜的流程，也便于使用[11]。響應面法的主要優點是減少評估多個參數及其相互作用的試驗所需的試驗次數，并產生了一個數學模型，能夠找出最佳值[12]。本研究使用響應面法優化提取多酚的3個變量，即超聲提取時間、乙醇體積分數、液料比[13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨果由龍里刺梨基地提供，選取無病蟲害的刺梨果，去籽、冷凍干燥、粉碎過1號篩待用。沒食子酸對照品（批號：110831-201204；純度≥89.9%），中國藥品生物制品檢定所；乙醇、Na2CO3等常規試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ALC-210.4電子天平（北京賽多利斯）；CARY100Bio紫外-可見分光光度計（美國瓦里安）；DY-H4-型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備）；移液槍（普蘭德上海）；80-2臺式低速離心機（上海醫療器械集團）；石英比色皿（江蘇晶玻玻瓶）；GZX-GFC-101-2-BS型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博泰實驗設備）。

1.3 試驗方法

1.3.1 刺梨多酚的提取

稱取刺梨果樣品1.0 g，選擇乙醇作為提取溶劑，超聲輔助提取刺梨果總多酚一定的時間，3 000 r·min-1離心15 min，取上清液定容至25 mL。

1.3.2 標準曲線的繪制及多酚含量的測定

稱取沒食子酸對照品適量，制成0.899 mg·mL-1的沒食子酸對照品溶液。取沒食子酸對照品溶液0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL、1.3 mL、1.5 mL和1.7 mL于25 mL量瓶中，加入F-C試劑5.5 mL，充分搖勻，加入7%碳酸鈉溶液7 mL，80 ℃水浴反應50 min，空白組以水代替樣品，在765 nm處測定吸光度，以沒食子酸質量濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，得回歸方程Y=7.119 6X-0.339 5（R=0.999 3），線性范圍為2.5～6.1 mg·L-1。以沒食子酸建立的標準曲線為參照，計算刺梨多酚的含量，并計算提取率[14]。

1.3.3 單因素試驗

（1）乙醇體積分數考察。固定提取條件為液料比30∶1（mL∶g），超聲提取時間40 min，分別考察乙醇體積分數30%、40%、50%、60%、70%和80%[15]對總多酚提取率的影響。

（2）超聲提取時間考察。固定提取條件為液料比25∶1（mL∶g），乙醇體積分數60%，考察超聲提取時間 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min對總多酚提取率的影響

（3）液料比考察。固定提取條件為乙醇體積分數60%，超聲提取時間40 min，設置液料比（mL∶g）為 5∶ 1、10∶ 1、15∶ 1、20∶ 1、25∶ 1和30∶1，考察液料比對總多酚提取率的影響。

1.3.4 響應面試驗

基于單因素對提取效率的考察結果，設計3因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗優化提取工藝，每組設定3個重復試驗，對提取條件進行優化，設計方案見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數考察結果

由圖1可知，隨著乙醇體積分數的增加，總多酚的提取率也逐漸增大，乙醇體積分數為60%時總多酚提取率最大，之后隨著乙醇體積分數的增加，提取率反而降低。可能是因為乙醇利于含羥基的多酚析出，在乙醇體積分數大于60%時，被一些更易溶的醇溶性雜質干擾，抑制了多酚類化合物的溶解。因此選擇乙醇體積分數為60%左右。

圖1 乙醇體積分數對提取率的影響

2.1.2 超聲提取時間考察結果

由圖2可知，總多酚提取率隨著超聲提取時間的延長先增大然后減小，超聲提取時間為40 min時，總多酚提取率最高，可能是因為長時間的超聲提取可使多酚擴散出來，但過長時間的超聲，破壞了多酚類化合物的酚羥基結構，導致提取率下降。故選擇超聲提取時間為40 min左右。

圖2 超聲提取時間對提取率的影響

2.1.3 液料比考察結果

由圖3可知，增加液料比，增加了傳質動力，增大了提取溶劑與反應物間之間的濃度差，多酚更易溶出，當液料比達到15∶1（mL∶g）后，提取率已呈現較為穩定的狀態，考慮到液料比太高不利于后續的濃縮以及純化工作，選擇15∶1（mL∶g）左右為提取時的液料比。

圖3 液料比對提取率的影響

2.2 響應面試驗

3因素3水平17組響應面試驗設計及試驗結果見表2。通過二次多元回歸擬合得到3個實驗試驗因子對刺梨果總多酚提取率（Y）影響的回歸模型，即Y=13.07+0.041X1+0.39X2+0.14X3-0.19X1X2+0.038X1X3-0.05X2X3-0.5X12-0.55X22-0.36X32，由回歸方程可知，對多酚提取率影響最大的是超聲時間。

表2 響應面設計編碼試驗

該模型方程方差分析和顯著性檢驗見表3。由表3可知，回歸方程中，一次項中X2極顯著，X1和X3差異都不顯著，說明超聲提取時間對刺梨果總多酚的提取率影響最大，乙醇體積分數和液料比對刺梨果總多酚提取率的影響較小。乙醇體積分數和超聲提取時間的交互項P值差異顯著，其他兩兩交互項均未達到顯著水平。3個因素的二次項和模型的P值差異均極顯著，模型的決定系數R2=0.978 1，說明97.81%響應值的變化能被該模型解釋，表明該模型具有較高的擬合度和可信度，可應用此模型對試驗結果進行分析和預測。

表3 多項式預測模型方差分析

回歸方程由三維響應面和二維等高線圖表示。可視化反映了各變量的試驗水平和兩個測試變量之間的相互作用的關系。圓形等高線圖表示相應的變量之間相互作用可忽略不計，橢圓形等高線圖表示相應的變量之間的相互作用顯著[16]。試驗中，乙醇濃度、超聲提取時間和液料比對提取率影響的結果見圖4。

由圖4可知，AB的等高線圖為橢圓形，說明兩因素之間交互作用顯著，即超聲時間和乙醇體積分數對總多酚得率的影響顯著，其他因素的等高線圖接近于圓形，說明其他因素的交互作用影響不顯著。回歸方程模型的方差分析結果與響應面圖反應的各因素之間交互作用結果一致。通過軟件分析得到最佳乙醇體積分數59.59%、最佳超聲時間47.37 min、最佳液料比16.08∶1.00。在此條件下總多酚提取率達到13.16%。

圖4 各因素交互作用對總多酚提取率的響應面圖和等高線圖

為驗證響應面優化的方法的可靠性，采用最優提取條件進行提取試驗，同時將總多酚最佳提取條件修正為乙醇體積分數60%、超聲時間48 min、液料比16∶1。重復3次驗證試驗，總多酚平均提取率為13.20%，預測值與實測值接近，見表4。因此，該工藝優化后的參數具有準確性和可靠性，可應用到實際操作中。

表4 驗證試驗結果

3 結論

試驗選擇響應面分析法優化刺梨果多酚的最佳提取條件，經試驗分析，刺梨果多酚的最佳提取條件為超聲提取時間48 min，乙醇濃度60%和液料比16∶1。在此條件下，提取率的平均提取率為13.20%，與預測值相吻合，說明該方法可以用于更好地開發利用刺梨果多酚資源。