染色體核型分析聯合CNV-Seq檢測在高齡孕婦產前診斷中的臨床應用

唐艷，盧守蓮，王玨

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院產科產前診斷中心，江蘇南京 210029

高齡孕婦是指預產期年齡≥35歲的孕婦，隨著三胎政策的提出，高齡孕婦不斷增多。高齡孕婦是染色體異常的高危人群[1],染色體的異常可引起胎兒組織、器官發(fā)育異常等。多年來傳統的產前診斷技術染色體核型分析一直作為診斷染色體畸變的金標準，能夠直觀地檢測出染色體數目異常、大片段的缺失重復及平衡易位等。但是染色體核型分析存在許多缺點如培養(yǎng)周期長耗時耗力，通常只能檢測5 Mb以上的異常[2]。近年來，隨著分子檢測技術的發(fā)展，高通量測序技術的出現為染色體畸變及染色體拷貝數變異檢測提供了新的手段。本研究回顧性分析2018年1月—2020年1月南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院368例高齡孕婦產前診斷羊水的染色體核型結果及基因組拷貝數變異測序(copy number variation sequencing，CNV-Seq)結果，探討二者聯合檢測在高齡孕婦中的臨床應用價值，為臨床醫(yī)生提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在本院進行產前診斷的高齡孕婦共368例，年齡35～48歲，孕周18～23周。通過羊膜腔穿刺術獲取羊水標本，并在臨床上進行胎兒染色體核型、CNV-Seq檢測與分析。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集孕婦術前排空膀胱，取平臥位，經B超檢測，基于無菌環(huán)境下，使羊水專用穿刺針經腹部穿刺，抽取30 mL羊水，其中的20 mL羊水實施細胞培養(yǎng)，以獲得染色體核型，其余的10 mL實現CNV-Seq檢測。

1.2.2 染色體核型分析 完成20 mL的羊水抽取工作后離心，離心時間為8 min，離心速度2 500 r/min，去上清液且將下層羊水細胞留下，并放在兩個培養(yǎng)瓶中接種。孕婦的每個樣本都需要實現雙線培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后換液，換液后繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d后觀察細胞生長狀態(tài)，根據細胞生長狀況進行收獲，常規(guī)制片、G顯帶，顯微鏡下計數30個中期分裂相，兩線鏡下各分析5個核型，如果遇到嵌合體，加倍計數分析，染色體圖像分析系統兩線采集保存3張圖片，核型結果參照《人類細胞遺傳學國際命名體制ISCN2013》進行描述。

1.2.3 CNV-Seq檢測 完成10 mL羊水抽取工作后，貝瑞和康公司完成CNV-Seq的樣本分析。在實際檢測中，主要針對的對象為染色體非整倍體變異、100 kb以上的CNV，具體方法為：提取待測樣本DNA；采用科諾安試劑盒進行PCR-free建庫；利用NextSeqCN500對建庫后的樣本進行測序；對測序的結果（fastq文件）進行質控，質控合格的樣本用于全基因組范圍上的CNV檢測；將檢測獲得的開放閱讀框（reads）與hg19參考基因組進行比對，按照基因組予以區(qū)間（bin）的劃分，對每個bin上的唯一數目進行比對，對陰性對照在區(qū)域內的唯一比對數值進行計算，后期還需要使用GDSW算法對染色體異常或CNV詳細分析。結果分為五類：致病、可能致病、臨床意義未明、可能良性、良性。

如果發(fā)現結果異常的孕婦，可以通過電話隨訪的方式追蹤，詳細記錄孕婦的妊娠結局和新生兒的健康情況。

1.3 統計方法

采用SPSS 24.0統計學軟件進行數據處理，計量資料使用（±s）表示，不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數（最小值～最大值）表示，采用t檢驗；計數資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 染色體核型分析結果

經過368例高齡孕婦的染色體核型檢測，發(fā)現有異常者為30例，染色體異常檢出率為8.2%（30/368），其中21三體7例，18三體2例，性染色體數目異常8例，嵌合體4例，染色體平衡變異6例，不平衡易位變異3例。

2.2 CNV-Seq檢測結果

CNV-Seq結果異常40例，異常檢出率10.9%（40/368），其中21三體7例，18三體2例，性染色體數目異常8例，嵌合體4例，≥10 Mb大片段缺失重復3例，＜10 Mb且 致 病 性CNVs3例，可 能 致 病 性CNVs3例，臨床意義未明CNVs10例。

2.3 染色體核型分析聯合CNV-Seq檢測

染色體核型檢測與CNV-Seq兩種方法對于染色體非整倍體異常檢出一致。而兩種方法對于4例嵌合體的檢出結果，差異有統計學意義（P＜0.05）。對于染色體核型分析檢出的3例不平衡變異，CNV-Seq也檢測出異常并且準確地檢出染色體異常的位點。見表1。此外，染色體核型分析檢出6例CNV-Seq未檢出的染色體平衡變異。見表2。CNV-Seq檢測出染色體核型未檢出的3例致病性CNVs，3例可能致病性CNVs，以及10例臨床意義未明的CNVs。見表3。

表1 應用不同檢測方法染色體核型結果對比

表2 不同染色體核型檢出的染色體平衡變異情況對比

表3 不同染色體核型致病性對比

續(xù)表3

對所有CNV結果異常的高齡孕婦進行電話隨訪。7例21三體綜合征均選擇終止妊娠，2例18三體均終止妊娠，8例性染色體異常中，1例超雌綜合征的孕婦33周早產，未見明顯異常，5例克氏綜合選擇終止妊娠，另外2例超雄綜合征孕婦足月分娩目前新生兒未見明顯異常。4例嵌合體中1例嵌合型21三體綜合征與2例嵌合型特納綜合征選擇終止妊娠，另外1例嵌合型特納綜合征失訪。3例致病性CNV均引產，3例可能致病CNV選擇繼續(xù)妊娠，出生后胎兒未見異常。10例臨床意義未明病例，其中5例做了父母CNV驗證，證實臨床意義不明片段來源于父母，隨訪7例足月分娩未見明顯異常，其余3例失訪。

3 討論

拷貝數變異（copynumbervaria-tion，CNVs）在人類基因組中存在廣泛，在1 000 bp上范圍內會發(fā)生缺失、插入、重復等多位點的復雜變異，一般是染色體亞顯微水平缺失或者重復，該情況的發(fā)生多是因為基因組重排導致的[3]。CNV-Seq主要是對CNV進行檢測，在全基因組范圍內完成，能夠對DNA進行全基因組低深度高通量測序，也能進行CNV的檢測，期間使用的方法為短序列比對、counts計算統計方法。

CNV-Seq多應用在果蠅的染色體CNV檢測、腫瘤基因組檢測中[4-5],后期開始檢測人類遺傳病有關的CNV。

本研究回顧性分析了368例高齡孕婦產前診斷的結果，共檢出30例異常，檢出率8.2%（30/368），其中21三體7例，18三體2例，性染色體數目異常8例，嵌合體4例，染色體平衡變異6例，不平衡易位變異3例。CNV-Seq檢測出異常40例，檢出率10.9%（40/368）。其中除了染色體核型結果6例平衡易位未檢出，其他24例致病性改變CNV-Seq均檢測出。此外CNV-Seq還額外檢測出3例CNV≤10 Mb明確致病性樣本，3例可能致病性樣本，占比1.6%（6/368），10例臨床意義不明樣本。3例CNV可能致病性病例均進行父母染色體CNV驗證，其中1例為母源性，另外2例為新發(fā)突變，3例病例孕婦均選擇繼續(xù)妊娠，出生后未見明顯異常。10例臨床意義未明病例中有5例選擇夫妻雙方CNV驗證，證實異常片段均來源于父母，另外5例未做驗證。10例病例3例失訪，其余7例出生后均未見明顯異常。

本研究中選取的均為高齡孕婦，即預產期年齡≥35歲的孕婦，368例高齡孕婦中染色體異常CNVSeq檢出率高于染色體核型檢測檢出率，由此可見CNV-Seq在高齡孕婦的產前診斷中具有重要的臨床意義。經過大量數據研究分析，產前診斷指征為高齡、血清學篩查提示染色體異常高風險或者因焦慮自愿選擇產前診斷的孕婦中，當染色體核型分析正常時，采用分子檢測手段還能發(fā)現額外1.0%～1.7%的具有臨床意義的CNV異常[6-7]。Wang J等[8]開展了3 429例產前診斷樣本前瞻性研究，其中包括高齡孕婦，研究提出CNV-Seq可作為產前診斷的一線檢測手段。吳曉霞等[9]通過高齡孕婦人群中CNV發(fā)生率研究，發(fā)現具有臨床意義的CNV發(fā)生率為1.9%。本研究染色體核型異常的孕婦中額外檢測出1.6%的具有臨床意義的CNV。

CNV-Seq用于產前診斷對比染色體核型分析，該方法需要的樣本少，且分析速度快、準確，具備較高的分辨率，能實現染色體微缺失、微重復檢測等優(yōu)勢。本研究中對于染色體核型正常的孕婦CNVSeq檢測額外檢測出6例具有臨床意義的CNV,并且對于大片段的染色體重復缺失，染色體核型雖然也能檢測出異常，但是由于染色體核型分析制片過程中受多種因素影響，有時顯帶并不是很理想，或者分辨率低無法準確地定位染色體斷裂的位點，CNV-Seq可準確地定位到染色體斷裂的位點[10-12]。染色體核型相比較CNV-Seq也有獨特的優(yōu)勢，可直觀觀察全染色體組形態(tài)，檢測染色體結構變異，可從形態(tài)學上解釋染色體異常機理。本研究中染色體核型分析準確地診斷出6例CNV-Seq無法檢測出的染色體平衡易位。因此，防止漏檢，高齡孕婦在行產前診斷羊水染色體核型檢測時可聯合CNVSeq檢測，提高染色體異常檢出率。CNV-Seq由于是全基因組隨機測序，測序位點沒有偏向，會增加更多的拷貝數變異[13-15]，能夠有效發(fā)現新基因，但工作量較大，臨床醫(yī)生可在羊膜腔穿刺前向孕婦交代清楚，由孕婦知情選擇。