miR-155在炎癥微環(huán)境下對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控作用

劉煜清，龔 瑤，趙蘇峰，戴 麗

牙周炎是累及牙周組織的慢性炎癥性疾病，會(huì)造成牙周支持組織破壞，嚴(yán)重者出現(xiàn)牙齒松動(dòng)脫落[1]。牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligment stem cells，PDLSCs)是參與牙周組織損傷及修復(fù)的重要細(xì)胞，具有成骨分化的潛能，但在牙周炎癥環(huán)境下，PDLSCs的成骨分化能力明顯減弱，不利于PDLSCs發(fā)揮損傷修復(fù)的生物學(xué)功能[2-3]。miR-155是一種對(duì)干細(xì)胞成骨分化具有抑制作用的miR[4]，有研究發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者牙周膜中miR-155的表達(dá)水平明顯增加[5]。本研究擬檢測(cè)miR-155在炎癥微環(huán)境下對(duì)PDLSCs成骨分化的調(diào)控作用，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(Sigma，美國(guó))；陰性對(duì)照(NC)miR、miR-155抑制物、miR-155模擬物(吉瑪，中國(guó))；miR提取試劑盒、miR cDNA第一鏈合成試劑盒、miR熒光定量檢測(cè)試劑盒、RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測(cè)試劑盒(天根，中國(guó))；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒(Promega，美國(guó))；成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(賽業(yè)生物，中國(guó))；Runx2、OCN、Col-Ⅰ、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)5、BMP10、GAPDH抗體(Abcam，英國(guó))；Ⅰ型膠原酶(Merck，德國(guó))。

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，德國(guó))；熒光定量PCR儀(ABI，美國(guó))；蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、凝膠成像儀(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2 離體牙收集

選擇2020年5月—2021年5月期間因正畸需要在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科進(jìn)行拔牙患者的前磨牙，均為健康牙，無(wú)根尖及牙體疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020(年)倫審【科】第(13)號(hào))，所有患者知情同意。

1.3 PDLSCs的培養(yǎng)及鑒定

刮取離體牙根中1/3的牙周膜組織，清洗后用3 g/L的Ⅰ型膠原酶37 ℃消化15 min，加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化后1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸并接種在培養(yǎng)皿內(nèi)，待從組織塊中爬出的細(xì)胞密度達(dá)90%后，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代繼續(xù)培養(yǎng)，選取第3代PDLSCs用于實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD44及CD90的陽(yáng)性表達(dá)情況。將細(xì)胞液滴加至載玻片上，按照各染色試劑盒說(shuō)明書方法分別滴加茜素紅、油紅O、阿爾辛藍(lán)染色液進(jìn)行染色處理，隨后封片，置于顯微鏡下觀察。茜素紅染色、油紅O染色、阿爾辛藍(lán)染色分別檢測(cè)PDLSCs的成骨、成脂、成軟骨能力。

1.4 PDLSCs分組

將PDLSCs按照不同處理方法進(jìn)行分組。①對(duì)照組：用空白培養(yǎng)基處理；②TNF-α組[6]：用含有10 μg/L TNF-α的培養(yǎng)基處理；③miR-NC組：轉(zhuǎn)染NC miR；④TNF-α+miR-NC組：用含有10 μg/L TNF-α的培養(yǎng)基處理，同時(shí)轉(zhuǎn)染NC miR；⑤TNF-α+miR-155抑制物組：用含有10 μg/L TNF-α的培養(yǎng)基處理，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-155抑制物；⑥miR-155組：轉(zhuǎn)染miR-155模擬物。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，各組處理24 h。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)

對(duì)照組和TNF-α組處理后24 h后，采用miR提取試劑盒提取細(xì)胞miR，miR cDNA第一鏈合成試劑盒將miR反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用miR熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)cDNA中的miR-155及U6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算miR-155的表達(dá)水平。

各組細(xì)胞干預(yù)24 h后，RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)cDNA中的 Runx2、OCN、Col-Ⅰ、BMP5、BMP10及β-actin進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算Runx2、OCN、Col-Ⅰ、BMP5、BMP10的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequence

1.6 Western blot檢測(cè)

使用RIPA裂解緩沖液提取各組細(xì)胞總蛋白，將等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，將膜與一抗Runx2、OCN、Col-Ⅰ、BMP5、BMP10、GAPDH(1∶2 000)在4 ℃過(guò)夜孵育。用TBST緩沖液洗滌后，與HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(Abcam, 英國(guó))(1∶1 500)在室溫下孵育1 h。使用ChemiDoc成像系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化分析。

1.7 茜素紅染色及定量分析

各組PDLSCs在成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)2周后，將其在4%多聚甲醛中固定30 min，室溫下與茜素紅染色溶液一起避光孵育30 min后，用PBS洗滌細(xì)胞以終止反應(yīng)。使用顯微鏡觀察鈣化結(jié)節(jié)形成情況。茜素紅染色后，用10%十六烷基吡啶溶液溶解鈣結(jié)節(jié)并在37 ℃下孵育30 min。然后，將上清液轉(zhuǎn)移至96孔板中，測(cè)定590 nm處的光密度用于茜素紅定量分析。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

starbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-155與BMP5、BMP10的結(jié)合位點(diǎn)，miR-NC組及miR-155組PDLSCs同時(shí)轉(zhuǎn)染BMP5或BMP10的雙熒光素酶報(bào)告基因，24 h后檢測(cè)報(bào)告基因的海腎熒光值、螢火蟲熒光值，將螢火蟲熒光值/海腎熒光值作為報(bào)告基因的熒光值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件錄入數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PDLSCs的鑒定

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD44及CD90的陽(yáng)性表達(dá)率均超過(guò)99%，符合干細(xì)胞特性(圖1)。茜素紅染色顯示，成骨誘導(dǎo)2周后，PDLSCs細(xì)胞間可見大量橘紅色的礦化結(jié)節(jié)；油紅O染色顯示，成骨誘導(dǎo)3周后，PDLSCs細(xì)胞質(zhì)中有較多的脂滴形成；阿爾辛藍(lán)染色顯示，成軟骨誘導(dǎo)5周后，有較多的軟骨細(xì)胞團(tuán)形成，阿爾辛藍(lán)染色陽(yáng)性，以上結(jié)果表明PDLSCs具有多向分化潛能(圖2)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD44、CD90陽(yáng)性表達(dá)情況Fig.1 Positive expression of CD44 and CD90 detected by flow cytometry

圖2 PDLSCs的鑒定( ×200)Fig.2 Identification of PDLSCs( ×200)

2.2 炎癥微環(huán)境下PDLSCs中各項(xiàng)指標(biāo)變化

與對(duì)照組比較，TNF-α組PDLSCs中miR-155的表達(dá)水平明顯升高，Runx2、OCN、Col-Ⅰ的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量以及鈣結(jié)節(jié)形成量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2～3、圖3～4)。

表2 炎癥微環(huán)境下miR-155及成骨標(biāo)志基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較Tab.2 Comparison between relative expression levels of miR-155 and osteogenic marker gene mRNA in inflammatory microenvironment

圖3 炎癥微環(huán)境下PDLSCs Runx2、OCN、Col-Ⅰ蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of Runx2, OCN and Col-Ⅰ proteins in PDLSCs under inflammatory environment

2.3 轉(zhuǎn)染miR-155抑制物對(duì)炎癥微環(huán)境下PDLSCs中miR-155表達(dá)的影響

TNF-α+miR-NC組PDLSCs中miR-155的表達(dá)水平高于miR-NC組及TNF-α+miR-155抑制物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表3 炎癥微環(huán)境下PDLSCs中成骨標(biāo)志基因蛋白相對(duì)表達(dá)量及茜素紅定量分析Tab.3 Relative expression of osteogenic marker gene protein and quantitative analysis of alizarin red in PDLSCs under inflammatory environment

圖4 炎癥微環(huán)境下PDLSCs的鈣化結(jié)節(jié)形成結(jié)果( ×200)Fig.4 Results of calcified nodule formation of PDLSCs in inflammatory microenvironment( ×200)

表4 轉(zhuǎn)染miR-155抑制物后炎癥微環(huán)境下PDLSCs中miR-155表達(dá)水平Tab.4 Expression level of miR-155 in PDLSCs in inflammatory microenvironment after transfection of miR-155 inhibitor

2.4 敲低miR-155對(duì)炎癥微環(huán)境下PDLSCs中成骨標(biāo)志基因表達(dá)及鈣結(jié)節(jié)形成的影響

與miR-NC組、TNF-α+miR-155抑制物組相比，TNF-α+miR-NC組PDLSCs中Runx2、OCN、Col-Ⅰ的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量及鈣結(jié)節(jié)形成量明顯降低(P<0.05)(表5～6、圖5～6)。

表5 敲低miR-155后炎癥微環(huán)境下PDLSCs中成骨標(biāo)志基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較Tab.5 Comparison of mRNA expression levels of osteogenic marker genes in PDLSCs in inflammatory microenvironment after miR-155 knockdown

A：miR-NC組；B：TNF-α+miR-NC組；C：TNF-α+miR-155抑制物組

表6 敲低miR-155后各組PDLSCs中成骨標(biāo)志基因蛋白相對(duì)表達(dá)量及茜素紅定量分析比較Tab.6 Comparison of relative expression of osteogenic marker gene protein and alizarin red quantitative analysis in PDLSCs of each group after miR-155 knockdown

圖6 敲低miR-155對(duì)炎癥微環(huán)境下PDLSCs中鈣結(jié)節(jié)形成的影響( ×200)Fig.6 Effect of miR-155 knockdown on calcium nodule formation in PDLSCs in inflammatory microenvironment ( ×200)

2.5 miR-155靶向BMP5、BMP10的驗(yàn)證

starbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-155與BMP5、BMP10的結(jié)合位點(diǎn)(圖7)。miR-155組PDLSCs中BMP5、BMP10的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量及BMP5、BMP10報(bào)告基因的熒光值均明顯低于miR-NC組(P<0.05)(圖8、表7)。

圖7 starbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-155與BMP5、BMP10的結(jié)合位點(diǎn)Fig.7 Starbase website predicts the binding sites of miR-155 with BMP5 and BMP10

圖8 BMP5、BMP10蛋白表達(dá)Fig.8 Expression of BMP5 and BMP10 proteins

表7 PDLSCs中BMP5、BMP10mRNA和蛋白表達(dá)水平及報(bào)告基因熒光值Tab.7 Expression levels of BMP5, BMP10mRNA and protein and fluorescence value of reporter gene in two groups of PDLSCs

2.6 敲低miR-155對(duì)炎癥微環(huán)境下PDLSCs中BMP5、BMP10 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

TNF-α+miR-NC組PDLSCs中BMP5、BMP10 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于miR-NC組和TNF-α+miR-155抑制物組(P<0.05)(圖9、表8)。

A：miR-NC組；B：TNF-α+miR-NC組；C：TNF-α+miR-155抑制物組

3 討 論

隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，PDLSCs等干細(xì)胞在牙周組織修復(fù)中的價(jià)值受到越來(lái)越多關(guān)注[7-8]。PDLSCs向成骨細(xì)胞分化后參與牙槽骨重建，可促進(jìn)牙周組織再生修復(fù)。但近年來(lái)相關(guān)研究顯示，牙周炎來(lái)源的PDLSCs成骨分化能力減弱，健康PDLSCs在TNF-α誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境下成骨分化能力也明顯減弱[9-10]，提示炎癥對(duì)PDLSCs的成骨分化具有抑制作用。因此，探究相關(guān)分子機(jī)制對(duì)于牙周炎治療具有重要的意義。

已知有多種miRs參與干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控，miR-155是一種能促進(jìn)牙周炎發(fā)展的miRNA[5]，有研究顯示過(guò)表達(dá)miR-155能夠抑制人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞成骨分化，而下調(diào)miR-155能夠促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[11-13]。此外，在多項(xiàng)牙周炎相關(guān)的研究中，炎癥對(duì)牙周組織中miR-155的表達(dá)具有促進(jìn)作用[5,14]。本研究利用TNF-α誘導(dǎo)炎癥微環(huán)境后發(fā)現(xiàn)PDLSCs中miR-155的表達(dá)水平也明顯增加。以上結(jié)果提示miR-155表達(dá)增加可能是PDLSCs在炎癥微環(huán)境下成骨分化能力減弱的分子機(jī)制。

表8 敲低miR-155后炎癥微環(huán)境下PDLSCs中BMP5、BMP10 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.8 Relative expression of BMP5 and BMP10 mRNA and protein in PDLSCs under inflammatory microenvironment after miR-155 knockdown

Runx2、OCN、Col-Ⅰ在成骨過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是反映成骨分化的標(biāo)志基因。Runx2直接調(diào)控成骨過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，加速細(xì)胞分化；OCN和Col-Ⅰ分別是成骨分化過(guò)程中產(chǎn)生的主要非膠原成分和膠原成分[15-16]。本研究結(jié)果顯示：在炎癥微環(huán)境下PDLSCs中Runx2、OCN、Col-Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)水平以及鈣化結(jié)節(jié)形成量降低，表明炎癥抑制PDLSCs的成骨分化，與既往研究的報(bào)道一致[9-10]。在炎癥微環(huán)境下敲低miR-155后，PDLSCs中Runx2、OCN、Col-Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)水平以及鈣化結(jié)節(jié)形成量增加，表明miR-155在炎癥微環(huán)境下抑制成骨分化，敲低miR-155后PDLSCs的成骨分化能力增強(qiáng)。

miR的生物學(xué)作用是在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，通過(guò)前期的生物信息學(xué)分析，BMP5和BMP10基因含有miR-155的靶向調(diào)控位點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，BMP可與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體結(jié)合激活BMP信號(hào)通路，促進(jìn)成骨相關(guān)因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化，BMP5和BMP10作為BMP信號(hào)通路上的成員，對(duì)牙周疾病的進(jìn)展具有調(diào)控作用，可加速骨細(xì)胞生成，改善牙齒缺損，修復(fù)損傷[17]。因此本研究選擇BMP5和BMP10基因?yàn)閙iR-155靶向位點(diǎn)進(jìn)行分析。已有研究報(bào)道，BMP5和BMP10參與干細(xì)胞的成骨分化，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、PDLSCs等多種干細(xì)胞的成骨分化具有促進(jìn)作用[18-19]。本研究進(jìn)一步證實(shí)miR-155模擬物可通過(guò)靶向調(diào)控BMP5和BMP10，顯著降低PDLSCs中BMP5和BMP10的mRNA、蛋白表達(dá)及報(bào)告基因的熒光值，表明miR-155直接靶向調(diào)控BMP5和BMP10，影響PDLSCs成骨分化。本實(shí)驗(yàn)在炎癥微環(huán)境下PDLSCs中檢測(cè)到BMP5和BMP10的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低；在炎癥微環(huán)境下敲低miR-155后，PDLSCs中到BMP5和BMP10的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加，表明靶向BMP5和BMP10是miR-155在炎癥微環(huán)境下調(diào)控PDLSCs成骨分化的可能分子機(jī)制。

綜上所述，炎癥微環(huán)境下PDLSCs中miR-155表達(dá)增加，敲低miR-155促進(jìn)炎癥微環(huán)境下PDLSCs成骨分化，靶向BMP5及BMP10是相關(guān)的分子機(jī)制。