重組人釉原蛋白促進人臍靜脈內皮細胞成血管分化作用的研究

莊齊翔，夏一如，董家辰，謝玉峰，束 蓉

牙周病可引起牙周支持組織發生不可逆性破壞，理想治療結果是實現牙周組織再生[1]。成血管作用是組織再生的關鍵步驟，新生血管可供給組織所需的營養物質及細胞因子[2]。內皮細胞(endothelial cell，EC)是參與成血管作用的主要細胞，人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)源自于臍帶靜脈內皮，能較好地模擬生理狀態下EC特性，是構建成血管細胞模型的良好基礎[3-4]。

釉基質蛋白(enamel matrix proteins，EMPs)屬于蛋白質混合物，是誘導牙周支持組織發育的重要成分，釉原蛋白(amelogenin，Am)是其主要的活性成分[5]。EMPs是天然提取的混合物，獲取困難、成本高昂、每次提取產量有限且不是純凈的Am。通過基因工程技術可制得單一組分的重組釉原蛋白 (recombinant amelogenin，rAm)，rAm來源廣泛、性質穩定、能批量純化獲得[6]。

豬或鼠來源的EMPs可促進HUVEC的成血管作用，但重組人釉原蛋白(recombinant human amelogenin，rhAm)的相關研究仍不足。因此本研究擬探討不同濃度rhAm對HUVEC成血管作用的影響，為后續rhAm在牙周組織血管化再生的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養基(Hyclone，美國)，胎牛血清、青霉素、鏈霉素、0.25%胰酶(Gibco，美國)，RNA反轉錄試劑盒(Takara，日本)，酶聯免疫檢測儀(Bio-Tek Instruments，美國)，倒置顯微鏡(Nicon，日本)，LightCycler 480Ⅱ(Roche，美國)，抗E-selectin抗體、抗VEGFR-2抗體(proteintech，中國)，抗VEGFR-1抗體、抗ICAM-1抗體(abcam，英國)，Matrigel Matrix(Corning，美國)。研究采用的rhAm是本課題組在前期實驗中，通過選擇BL21/pET28a-His-SUMO-rhAm表達系統，在適宜條件下，經誘導表達融合蛋白His-SUMO-rhAm，酶切純化得到25 ku全長rhAm。

1.2 HUVEC培養

將HUVEC細胞系EA.Hy926(AllCells，美國)在DMEM培養液(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素)中復蘇，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待皿底細胞匯集至90%，使用0.25%胰酶消化，按1∶3傳代，將復蘇后3代內且生長狀態良好的細胞進行實驗。

1.3 MTT法檢測

將HUVEC以2×104個/mL濃度接種于96孔板中，每孔100 μL，標準條件下培養24 h。將細胞分為5組，對照組為空白培養液，其余各組分別含0.1、10.0、50.0、100.0 μg/mL rhAm(各組均不含胎牛血清)，每組設5個副孔。按上述分組更換培養液，標準條件下培養，分別觀察1、2、3、4、5 d后，每孔加入150 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃、5% CO2培養箱孵育4 h后棄除孔內液體，再加入200 μL二甲基亞砜，振蕩器震蕩5 min。使用酶聯免疫檢測儀測其在波長490 nm處的OD值，根據OD值繪制生長曲線。

1.4 劃痕實驗

將HUVEC以3×105個/mL濃度接種于6孔板中，每孔加入2 mL，培養至HUVEC爬滿皿底，取200 μL槍頭垂直孔底作一劃痕后，換用空白培養液(對照組)或含10.0 μg/mL rhAm的培養液繼續培養(均不含胎牛血清)，每組設3個副孔，每24 h倒置顯微鏡觀察HUVEC的遷移，拍照記錄。

1.5 實時熒光定量PCR

將HUVEC以3×105個/mL濃度接種于6孔板中，每孔加入3 mL，培養24 h后換用空白培養液(對照組)或含10.0 μg/mL rhAm的培養液繼續培養(均不含胎牛血清)，每組設3個副孔，培養24 h后棄去培養液，加入適量Trizol進行細胞裂解，提取細胞總RNA，TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，采用SYBR綠色熒光法檢測細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1， ICAM-1)、E-選擇素(E-selectin)、血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)和VEGFR-2的mRNA表達變化。本實驗所用的引物序列參見表1。

表1 成血管相關基因的實時熒光定量PCR引物Tab.1 Specific primer sequences used for real-time PCR angiogenesis-related genes

1.6 蛋白免疫印跡檢測

將HUVEC細胞以3×105個/mL濃度接種于6 孔板中，每孔加入3 mL，培養24 h后換用空白培養液(對照組)或含10.0 μg/mL rhAm的培養液繼續培養(均不含胎牛血清)，每組設3個副孔，培養24 h后棄去培養液，加入適量細胞裂解液，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度后以等量蛋白量進行凝膠電泳，轉至PVDF膜，膜封閉，孵育一抗E-selectin、GAPDH、ICAM-1、VRGFR-2(均為1∶1 000)；VEGFR-1(1∶2 000)，洗膜，孵育二抗FITC抗兔IgG(1∶5 000)，ECL顯影。

1.7 小管生成實驗

取48孔板，每孔加入150 μL Matrigel Matrix鋪底，標準條件下培養1 h成膠。將HUVEC以1×106個/mL濃度接種于48孔板中，分別加入空白培養液(對照組)或含10.0 μg/mL rhAm的培養液(均不含胎牛血清)，每組分配3個副孔，每4 h倒置顯微鏡觀察，待HUVEC排列成小管結構后拍照記錄。

1.8 統計學分析

取各副孔平均值作為結果，每組實驗重復3次。采用SPSS 26.0、GraphPad Prism 9.1.1、ImageJ軟件對實驗數據進行分析，雙因素方差分析和配對t檢驗進行統計。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 rhAm對HUVCE增殖的影響

不同濃度rhAm對HUVEC增殖影響的檢測結果見圖1。對照組HUVEC在第2天細胞數量開始增加，隨后進入對數生長期，第4天進入平臺期。0.1 μg/mL rhAm組的細胞數量在5 d內呈穩定增加，在第5天時與對照組相比有統計學差異(P<0.05)；10.0 μg/mL rhAm組的細胞數量從第3天開始快速增加，第4天達到高峰，細胞數量明顯高于對照組(P<0.05)，第5天時細胞數量開始下降；50.0 μg/mL rhAm組的細胞數量在5 d內穩定增加，但與對照組相比無明顯差異；100 μg/mL rhAm組的細胞數量在第1～3天內穩定增加，但第3天后細胞數量出現明顯下降，第5天時其細胞數量明顯低于對照組(P<0.01)。MTT檢測結果顯示10.0 μg/mL rhAm在刺激HUVEC 24 h后對HUVEC增殖的促進效果相對最佳，因此后續實驗選擇10.0 μg/mL作為刺激濃度。

與對照組相比，*：P<0.05，**：P<0.01

2.2 rhAm對HUVEC遷移的影響

24 h時，對照組的愈合面積約占劃痕面積的3/4，10.0 μg/mL rhAm組的劃痕則已完全愈合，愈合面積與對照組相比存在統計學差異(P<0.05)；48 h時，對照組的劃痕也達到完全愈合(圖2)。

A：對照組和10.0 μg/mL rhAm組不同時間點HUVEC遷移情況( ×40)；B：劃痕愈合面積，與對照組相比，*：P<0.05

2.3 HUVEC中成血管相關mRNA的表達

培養24 h后，10.0 μg/mL rhAm組中ICAM-1、E-selectin、VEGFR-1和VEGFR-2的mRNA相對表達量均高于對照組，其中ICAM-1(P<0.01)、E-selectin(P<0.05)mRNA表達與對照組相比存在統計學差異(圖3)。

與對照組相比，*：P<0.05，**：P<0.01

2.4 HUVEC中成血管相關蛋白的表達

在蛋白水平上，10.0 μg/mL rhAm濃度下，HUVEC的ICAM-1、E-selectin、VEGFR-1和VEGFR-2表達在24 h時增強，其中ICAM-1的表達與對照組相比存在統計學差異(P<0.01)(圖4～5)。

2.5 rhAm對HUVEC成管的影響

16 h時，對照組與10.0 μg/mL rhAm組均表現出明顯的成管效果；20 h時，兩組成管趨于穩定，成管效果無顯著差異(圖6)。

圖4 rhAm對HUVEC中成血管相關蛋白表達的影響Fig.4 The effect of rhAm on the expression of angiogenesis-related proteins of HUVEC

與對照組相比，**：P<0.01

3 討 論

使已喪失的牙周支持組織得到修復和再生是牙周病的治療難點。近年來，隨著組織工程和干細胞再生技術的日趨成熟，結合種子細胞、生長因子及支架材料的牙周組織工程已成為牙周組織再生研究中的新興熱點[7-8]。Am在EMPs中的占比達90%，克隆Am的成熟肽編碼區基因，經過載體構建、基因表達、產物分離和純化后，可得到純凈的rAm。林智愷等[9]的研究顯示rhAm可促進牙周膜成纖維細胞(periodontal ligament cell，PDLC)的增殖、遷移和黏附；Hakki等[10]研究發現rhAm可上調成牙骨質細胞對Ⅰ型膠原纖維(collagen type Ⅰ，COL Ⅰ)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)和牙骨質附著蛋白(cementum attachment protein，CAP)等成牙骨質相關基因的表達；廖蔚文等[11]發現rhAm在炎癥微環境下可抑制人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament cell，hPDLC)中炎癥相關細胞因子的表達，上述實驗均提示rhAm有促進牙周組織修復和再生的能力，是牙周組織工程常用的生長因子之一。

圖6 rhAm對HUVEC成管的影響( ×40)Fig.6 The effect of rhAm on the tube formation of HUVEC( ×40)

成血管作用是組織修復和再生過程中的關鍵步驟，組織內既存的內皮細胞前期細胞(endothelial progenitor cell，EPC)或是脫離成熟血管壁基底膜的EC，在發生細胞增殖的同時也向組織缺損區遷移，EC在此過程中會構建成管狀結構，最終形成成熟的血管，并與周圍血管產生吻合，達成血管的新生[2,12]。PDLC是牙周膜的主要細胞，Amin等[13]的研究指出富含酪氨酸的釉原蛋白多肽(tyrosine-rich amelogenin peptide，TRAP)可促進PDLCs分化成EC，此外，牙周膜是高度血管化的結締組織，這都奠定了牙周組織血管化再生的基礎。

本研究發現低濃度(0.1、10.0 μg/mL)rhAm在早期對HUVEC的增殖無明顯作用，隨著時間累積，在后期可對細胞增殖起到促進作用；但高濃度(100.0 μg/mL)rhAm在后期會對細胞增殖產生抑制作用。釉基質蛋白衍生物(enamel matrix derivatives，EMD)是EMPs精制、純化后的產物，Andrukhov等[14]的研究顯示低濃度的8～55 ku EMD成分在刺激24 h后對HUVEC的增殖無促進作用，但高濃度的8～55 ku EMD成分對細胞有抑制作用，其結果與本研究相似。

EC的遷移是成血管過程的重要步驟[12]，本實驗通過劃痕實驗模擬成血管過程中HUVEC橫向遷移的能力。實驗結果發現rhAm能明顯促進HUVEC的遷移，加快劃痕的愈合。Jonke等[15]采用Transwell法同樣也發現TRAP可促進HUVEC的遷移。

牙周組織的炎癥環境會降低牙周組織再生相關細胞的分化能力，影響細胞的生物學特性和牙周組織的再生[16]。ICAM-1和E-selectin是存在于EC表面的黏附分子，兩者在炎癥介質的刺激下會上調表達，可促進炎癥細胞的黏附，并招募這類細胞向病損區域遷移，此外，ICAM-1還參與EC的遷移[17-18]。本實驗的結果顯示，rhAm可顯著提高HUVEC對ICAM-1的表達，同時也提高對E-selectin的mRNA表達。Andrukhov等[14]研究指出EMD、8～55 ku EMD成分和小于8 ku的EMD成分均會提高HUVEC中ICAM-1和E-selectin的表達。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管新生過程中重要的調節因子，VEGFR-1和VEGFR-2是表達于EC表面的VEGF受體[19]。被激活的VEGFR-1會誘導EC和炎性細胞的遷移、促進炎性細胞因子的分泌、招募髓系祖細胞、激活蛋白水解酶，在炎癥等病理性血管新生中發揮重要作用[19]。被激活的VEGFR-2表現出較強的成血管活性，可誘導造血細胞分化為EC，抑制EC的凋亡，促進EC的增殖、遷移和血管的形成，不僅直接參與胚胎發育期間的血管發生，同時還促進生理性及病理性的血管新生[19]。Afacan等[20]的研究指出牙周炎患者齦溝液中的VEGF濃度較牙周健康者高，提示牙周炎會提高牙齦組織的VEGF濃度。本實驗結果顯示rhAm有上調HUVEC表達VEGFR-1和VEGFR-2的趨勢。Jonke等[15]研究顯示，10 μg/mL TRAP和EMD有上調HUVEC表達VEGFR-1和VEGFR-2的趨勢，50 μg/mL TRAP和EMD則可顯著上調。在本次實驗中，VEGFR-1和VEGFR-2的上調程度不明顯可能與rhAm的刺激濃度不足有關。rhAm可能通過提高EC中ICAM-1、E-selectin和VEGFR-1的表達，誘導炎癥細胞向牙周組織病損區聚集，加快病原微生物和壞死組織的清除，有助于牙周組織的愈合；另一方面，rhAm使VEGFR-2表達上調有助于EC的增殖，ICAM-1、VEGFR-1和VEGFR-2表達增多也可促進EC的遷移。

本實驗觀察HUVEC體外成管效果后發現不含rhAm或含10.0 μg/mL rhAm的培養液均能誘導HUVEC排列成小管樣結構，且兩組之間差異不明顯。Jonke等[15]的研究顯示10 μg/mL TRAP在標準條件下培養15 h后可誘導HUVEC排列成小管樣結構，且較對照組有明顯差異。VEGF與VEGFR-2結合后，可促進HUVEC的成管作用[19]，本實驗雖然提示10.0 μg/mL rhAm有上調HUVEC表達VEGFR-2的趨勢，但該結果與對照組相比無統計學意義，且本實驗選用的基質膠不含VEGF，可能是導致本次小管生成實驗差異不明顯的原因，如果參考Jonke等[15]的研究結果，選擇同樣的實驗條件，提高rhAm的濃度使HUVEC增強對VEGFR-2的表達，同時選用含VEGF的基質膠，可能會得到與目前不一樣的實驗結果。

本研究發現rhAm可促進HUVEC的增殖和遷移，上調細胞黏附蛋白的表達，提示rhAm在牙周組織局部的炎癥環境中有促進組織內血管新生及調節組織炎癥的作用。如何在牙周病治療中應用rhAm，解決牙周組織局部炎癥的同時也促進病損組織的血管新生，將是今后的重點研究方向。