堿性蛋白酶水解牛血清蛋白工藝研究

趙夢瀟，張鈺璇,2, 魏晨佳，曹 忻,2，楊具田,2，高丹丹,2★

（1.西北民族大學生命科學與工程學院 730124；2.西北民族大學生物醫學研究中心 730030）

隨著我國養殖業的快速發展，人們對牛肉的消費需求不斷上升，其中牛血液作為屠宰加工副產品而面臨著亟待解決的資源浪費問題。經研究發現，牛血液約占其活體重的4.0%～9.8%[1]，被屠宰后一般可收集到總血量60%～70%。新鮮血液中富含多種蛋白質、氨基酸、維生素，以及人體所需的無機鹽與鈉、鉀、鐵、鈣等元素[2]，但由于牛血液血腥味重、消化性差、食用率不高等因素，常作為屠宰廢棄物排放，不僅造成蛋白資源的浪費，還給環境帶來極大的壓力[3]。

牛血液中蛋白質含量在17%左右，其中以血清蛋白占比最高。畜禽動物血清蛋白水解后的多肽液易于被人體吸收利用，目前常采用酶解法水解血清蛋白制備生物活性肽，提高血液利用率和消化率。有研究報道酶解法可用于生產動物蛋白復合產品，以其低成本、高產量、生產條件溫和、方便操控的優勢，逐漸受到人們的青睞。Adje[4]等采用胃蛋白酶水解牛血紅蛋白得到抑菌肽，湯鳳霞[5]等利用酶解法水解豬血制備食用水解蛋白，胡濱[6]利用胰蛋白復合酶法水解豬血蛋白制備游離氨基酸和功能肽，多項研究證明酶解法水解動物蛋白可制備高附加值的功能性肽。由此可見，采用酶法水解動物血清蛋白制備生物活性肽具有廣闊的發展前景。

本研究選用堿性蛋白酶水解蛋白，主要通過對比不同反應溫度、pH、水解時間和加酶量的條件下堿性蛋白酶水解牛血清蛋白的水解度來分析水解牛血清蛋白的最適條件，通過響應面優化試驗設計對水解條件進行優化分析，為解決屠宰副產物血液資源的污染問題提出新的轉化思路和途徑，為牛血清蛋白和多肽的綜合利用奠定了實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗原材料 新鮮牛血：采自蘭州忠華牛羊屠宰場18 月齡肉牛。

1.1.2 試劑 堿性蛋白酶（酶活力200 U/mg），購自上海源葉生物有限公司；茚三酮、TCA、VC，均購自美國Sigma 公司；氫氧化鈉、檸檬酸鈉、鹽酸、正丁醇、正丙醇，均購自上海生工公司，其余均為國產分析純試劑。

1.1.3 主要儀器 pH 計（尤尼科儀器有限公司）；HW328型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；JA2003N 電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；TGL-16M 高速臺式冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；722 型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 牛血清蛋白酶解液的制備工藝 新鮮牛血→抗凝血（2.5%檸檬酸鈉）→離心（4℃，6500r/min，15min）→取上清液→醇沉離心（4℃，6500r/min，15min）→取上清液冷凍干燥（-20℃）→牛血清蛋白粉→5%牛血清蛋白溶液→調節pH（pH=12）→水解（堿性蛋白酶3000 U/g，55℃，5h）→滅酶（95℃，1min）→沉降蛋白質（2mL 10% TCA）→離心（4℃，10000r/min，15min）→收集上清液保存備用。

1.2.2 水解度的測定 采用羅艷華[8]、高丹丹[9]等人的方法測定氨基酸含量。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL 質量濃度為100μg/mL 的甘氨酸標準溶液于比色管中，加水補足至2mL，分別滴加 1.2%茚三酮顯色劑1mL和 1%的VC 0.1mL，混勻后95℃水浴保溫15min，冷卻至室溫，用40%的乙醇定容至40mL，在570nm 波長處測定溶液吸光值，并根據甘氨酸含量與吸光值繪制標準曲線。得到的曲線回歸方程為y=0.0081x+0.014，R2=0.9983，由數據可見，在試驗取值范圍內甘氨酸含量與吸光值呈良好的線性關系。

水解度（Degree of Hydrolysis，DH）的計算公式：

式中：Ah，酶解液中的總游離-NH2總量（mmol）；A0，原料蛋白中原有的總游離-NH2數（mmol）；A1，原料蛋白經強酸水解后的總游離-NH2數（mmol）。

1.2.3 單因素實驗設計 為優化牛血清蛋白水解工藝，取5 mL 的5%牛血清蛋白溶液作為底物，以牛血清蛋白的水解度為指標，考察不同溫度（55℃、60℃、65℃、70℃、75℃）、pH（9、10、11、12、13）、水解時間（2、3、4、5、6h）和加酶量（1000、2000、3000、4000、5000U/g）對堿性蛋白酶水解效果的影響。

1.2.4 響應面實驗設計 為考察酶解溫度（A）、pH（B）、水解時間（C）和加酶量（D）四個單因素對蛋白水解程度的共同影響，以牛血清蛋白的水解度為響應值設計四因素三水平響應面試驗，并運用Box-Behnken 進行中心組合實驗設計。響應面試驗設計因素和水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素和水平

1.2.5 數 據 處 理 采 用Origin 9.0、Design-Expert.8.0.6、SPSS 25 軟件對實驗數據進行制圖及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 溫度對牛血清蛋白水解度的影響 溫度對牛血清蛋白水解度的影響如圖1 所示，在50℃～70℃范圍內，水解度隨著溫度的升高呈現先增加后下降的趨勢，在65℃處水解度有最大值，為16.94± 0.24%。當溫度超過65℃后，水解度與溫度呈負相關，這是由于超過酶解反應的最適溫度會導致酶空間結構發生變化；當水解溫度過高時，堿性蛋白酶還會失活，使酶解反應受到抑制[10]。這與張志翔[11]等得到的時間延長會降低水解度的實驗結論相符合。所以，確定最適的水解反應溫度為65℃。

圖1 溫度對水解度的影響

2.1.2 pH 對牛血清蛋白水解度的影響 pH 對牛血清蛋白水解度的影響如圖2 所示，pH 在9 ～13 范圍內，隨著pH 的增加牛血清蛋白水解度呈現先升高后明顯下降的趨勢，在pH 值為12 時，牛血清蛋白的水解度達到最大值，為18.07 ± 0.26%，這是由于當pH 大于12 時，強堿會破壞蛋白質結構[12]，抑制蛋白酶的活性，導致水解度降低。這與鄒澤斌[13]等得到的pH過大或過低均會降低蛋白質水解度的實驗結論相符合。所以，確定最適的水解反應pH 為12。

圖2 pH 對水解度的影響

2.1.3 水解時間對牛血清蛋白水解度的影響 水解時間對牛血清蛋白水解度的影響如圖3 所示，在2 ～6h 范圍內，水解度與反應時間呈正相關的趨勢。在2 ～4h 內，酶解反應比較充分，牛血清蛋白的水解速率較大，而4h 后蛋白質的水解速率減慢。這是由于反應時間的延長使得反應底物減少，且酶解產物增多增強了對酶的抑制作用，從而減緩了水解反應[14]。綜合考慮經濟和時間因素，確定最適水解時間為4h。

圖3 水解時間對水解度的影響

2.1.4 加酶量對牛血清蛋白水解度的影響 加酶量對牛血清蛋白水解度的影響如圖4 所示，在1000 ～5000U/g 范圍內，水解度隨加酶量的變化呈正相關趨勢，但當加酶量超過2000U/g后水解度增加趨勢緩慢。這是由于當底物充足時，酶量的增加可以增強酶與底物的結合度，增大酶與底物的接觸率，從而提高了水解程度[15]。當加酶量達到一定范圍后，由于酶濃度逐漸接近飽和，底物的量不斷減少，繼續提高加酶量不會對水解度造成顯著影響?？紤]到實際生產耗能和生產成本的問題，確定最適加酶量為2000 U/g。

圖4 加酶量對水解度的影響

2.2 響應面法優化堿性蛋白酶水解牛血清蛋白結果分析

2.2.1 多元二次模型方程的建立及檢驗 以5%牛血清蛋白溶液為反應底物，在單因素試驗結果的基礎上，用響應面法分析堿性蛋白酶影響牛血清蛋白水解度高低的酶解工藝，并進行四因素三水平實驗設計[16-17]，采用中心Box-Behnken 組合試驗設計出29 組實驗，其中5 組為中心點重復實驗。對溫度、pH、酶解時間和加酶量四個單因素條件進行優化的試驗設計及數據處理結果見表2。

表2 響應面試驗設計及數據處理

根據響應面試驗結果得到二次回歸方程為：DH=23.19-0.20A-3.17B+1.61C+2.63D+0.033AB+0.10AC+0.13AD-0.86BC+0.14BD-0.62CD-1.72A2-4.87B2-1.56C2-2.24D2。對二次多元回歸模型進行方差分析，結果如表3 所示。

表3 二次多項模型方差分析表

由上述方差分析表可知，總模型的P＜0.0001，說明該二次多元回歸模型具有高度的顯著性[18]。失擬項P=0.2617＞0.05，表示在失擬項α=0.05 水平上，由于非試驗因素對試驗結果造成的影響不顯著。決定系數R2=0.9747，校正決定系數R2Adj 為0.9495，能解釋實驗中94.95%響應值的變化，實驗誤差小，說明模型有良好擬合程度，該回歸方程可用于預測和代替堿性蛋白酶水解牛血清蛋白工藝研究中的試驗點。

對所得回歸方程的回歸系數進行顯著性檢驗，結果如表4，經比較各因素在堿性蛋白酶水解牛血清蛋白過程中對水解度的影響，得到的結果為：B、C、D 對水解度影響均達到極顯著水平（P＜0.001），各因素對水解度的影響強弱為B＞D＞C＞A。

表4 回歸方程系數顯著性檢驗

2.2.2 響應面分析和優化 通過Design-Expert.8.0.6 軟件對回歸模型制作響應曲面圖，探究溫度、pH、水解時間和加酶量之間相互作用產生的影響，以交互作用對水解度的影響程度作為分析依據來確定最佳因素水平的范圍。響應曲面的陡峭程度能反映出牛血清蛋白質的水解度對試驗因素的敏感程度，響應面坡度平緩表示水解度對于因素的變化不敏感，坡度陡峭表示水解度對于因素的變化非常敏感[18]。由圖5 可知，溫度和pH、pH 和水解時間、pH 和加酶量的交互作用形成的響應曲面坡度比較陡峭，且在pH 變化方向上曲線變化明顯；而溫度和水解時間、溫度和加酶量、水解時間和加酶量交互作用形成的曲面圖則比較平緩，且在溫度變化方向上曲線變化最平緩。結合顯著性分析結果比較，說明pH、水解時間和加酶量的交互效應對堿性蛋白酶水解牛血清蛋白影響顯著，且pH 對蛋白水解度的影響最大，溫度對水解度的影響最小。

圖5 兩因素交互作用對水解度的曲面圖

2.2.3 模型驗證實驗 根據Box-Behnken 試驗和二次多項回歸方程模型結果，在牛血清蛋白水解度達到最高值的基礎上優化溫度、pH、水解時間和加酶量四個因素，當實驗條件為：酶解溫度64.85℃、pH11.64、水解時間4.52h、加酶量2500U/g，水解度可達到24.85±0.15%。為了驗證實驗的準確性，在預測的最佳條件下開展水解實驗，試驗平行測定3 次得到的水解度結果為24.76%、25.02%、24.83%，經計算得標準偏差（SD）=0.001098，表明該模型能比較好地預測實際水解情況。

3 結論

本試驗在單因素實驗基礎上，通過考察溫度、pH、水解時間、加酶量對堿性蛋白酶水解牛血清蛋白水解度的影響，利用響應面法對影響水解條件的因素進行探究，優化堿性蛋白酶水解牛血清蛋白最佳工藝參數，考慮到實際操作條件，最終確定最佳水解條件為溫度65℃、pH 11.6、水解時間4.5h、加酶量2500U/g，經優化得到的水解度可達到24.85±0.15%。本實驗研究證明，響應面分析法可以有效的優化堿性蛋白酶水解牛血清蛋白工藝條件，提高牛血清蛋白的利用率和血液資源的利用，減少浪費，保護環境，防止血液污染，也給牛血清的開發和利用帶來更廣闊的應用前景。