液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用定量分析食品中苯嘧磺草胺殘留

袁 曉，李 青，李麗君，鄭美娟

（1. 廣電計量檢測（湖南）有限公司，湖南 長沙 410221；2. 貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550002）

苯嘧磺草胺是由巴斯夫公司開發(fā)的一款脲嘧啶類除草劑。化學名稱N'-[2-氯-4-氟-5-(3-甲基-2,6-二氧-4-(三氟甲基)-3,6-二氫-1(2H)-嘧啶)苯甲酰]-N-異丙基-N-甲基硫酰胺，分子式C17H17ClF4N4O5S，分子量500.85[1]。對于草甘磷和乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制劑如磺酰脲類、嘧啶水楊酸類有抗性的闊葉雜草和一些莎草科雜草，苯嘧磺草胺有較好的防治效果，其主要作用機制是抑制光合系統(tǒng)中的原卟啉原IX 氧化酶（PPO）活性，造成原卟啉IX（Proto）及過氧化氫在葉片組織中積累，在光照下Proto 分子與氧反應形成單態(tài)氧與氧基，使細胞膜的不飽和脂肪酸過氧化，造成膜的透性與功能迅速喪失，導致組織壞死、生長受抑制和植株死亡[2]。

GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中針對不同的動物和植物源性食品規(guī)定了苯嘧磺草胺的臨時限量（0.01～1 mg/kg）[3]，但是沒有指定檢測方法。查閱現(xiàn)行有效的農(nóng)藥殘留標準，也未找到相關的檢測標準。在《關于在各種食品中設立苯嘧磺草胺最大殘留限量的合理化意見》（EFSA 2012b）[4]中提到了歐洲食品安全局建立的苯嘧磺草胺檢測方法，采用高效液相色譜串聯(lián)質譜，提取溶劑為甲醇水溶液（70/30, v/v）和乙腈，定量限為0.03 mg/kg（植物源性食品）和0.01 mg/kg（動物源性食品），具體的色譜和質譜條件沒有披露。

苯嘧磺草胺是一種新型農(nóng)藥殘留，目前，國內針對苯嘧磺草胺的相關研究報道很少，現(xiàn)有的文獻報道都是涉及藥物合成[5-6]、除草活性測定[7-8]及原藥中含量測定[9-10]。原藥中苯嘧磺草胺測定方法為液相色譜法，前處理為直接溶解上樣，對于復雜的植物源性食品和動物源性食品中低含量苯嘧磺草胺的檢測方法還未見報道。檢測方法的缺失必然會給農(nóng)藥殘留量監(jiān)測和施用控制帶來隱患，本研究旨在建立一種液相色譜串聯(lián)質譜法測定食品中苯嘧磺草胺殘留量的方法，為苯嘧磺草胺的代謝研究和監(jiān)管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

高效液相色譜質譜儀：Waters XEVO TQ-S micro（美國沃特世公司）；超高速冷凍離心機[力新儀器(上海)有限公司]；氮吹儀（上海安譜實驗科技有限公司）；渦旋振蕩器（上海邁旗環(huán)保科技有限公司）；電子天平（ME204E，梅特勒托利多公司）；固相萃取儀（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）；ProElut DPC 固相萃取柱（迪馬科技有限公司）；0.22 μm 的有機濾膜（迪馬科技有限公司）。

乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；甲酸（99%）；氯化鈉（分析純），苯嘧磺草胺標準品，均購自上海安譜科技有限公司。

1.2 試劑與樣品

標準儲備液：苯嘧磺草胺標準品（PESTANAL?），CAS 號372137-35-4，純度≥99%。準確稱取0.01 g苯嘧磺草胺標準品于10 mL 容量瓶，加入乙腈溶解后定容至刻度。配制成濃度為1 000 μg/mL的標準儲備液。于-18℃保存，有效期6 個月。

標準工作液：準確移取0.1 mL 的標準儲備液于10 mL 容量瓶，用乙腈定容，配制成濃度為10 μg/mL的標準中間液，于-18℃保存，有效期1 個月。

1.3 樣品處理

準確稱取2.00 g 樣品（豬肉、雞蛋、上海青、梨、牛奶）于離心管，加入10 mL 乙腈和4.00 g NaCl，混合渦旋1 min，超聲提取10 min，6 000 r/min 離心5 min，取5 mL 上清液待凈化。加10 mL 乙腈活化固相萃取柱，棄去上清液，將待凈化液加入小柱，收集流出液，加入10 mL 乙腈，合并流出液，50 ℃水浴氮吹至近干，用1 mL 乙腈溶劑殘留物，過0.22 μm 濾膜后供液相色譜質譜儀測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相條件液相條件如下：色譜柱為C18 柱（2.6 μm，100 mm×3 mm）；流速0.4 mL/min，進樣量1.0 μL，柱溫35℃，流動相A 相為0.1%甲酸水，B 相為乙腈。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4.2 質譜條件質譜條件如表2 所示。掃描模式MRM 掃描，正負離子同時掃描，氣簾氣30 Psi，離子化電壓正離子+5 500V，負離子-4 500V，去溶劑氣溫度550℃，噴霧氣Gas1：55 Psi，輔助加熱氣Gas1：55 Psi。

表2 苯嘧磺草胺質譜條件

2 結果與分析

2.1 前處理條件確認

在雞蛋樣品中加入一定濃度的目標物，混合均勻后于4℃放置24 h。稱取同等質量的多份上述雞蛋樣品，加入100 μg/kg 苯嘧磺草胺標準物，分別加入5、10、12、15 mL 的乙腈，加入同樣質量的NaCl，超聲提取凈化后進行測定。

表3 是采用不同體積的乙腈提取加標樣品后獲得的峰面積、響應值和檢測值。結果表明，隨著提取體積的增加，目標物的檢測值依次增加，10 mL 與5 mL相比檢測值增加明顯，而使用12 mL 和15 mL 溶劑提取后，峰面積與檢測值無明顯差異，說明10 mL 乙腈的提取效率已可滿足前處理的需要，最終選擇10 mL 作為提取液體積，不同提取液體積測試結果對比見表3。

表3 不同體積提取溶劑結果對比

2.2 儀器條件的確定

選擇乙腈-水、甲醇-水、甲酸水-乙腈的流動相組合進行比對，主要考察目標物的分離度，同濃度下的響應值，在以乙腈∶0.1%甲酸溶液為流動相時，各目標物的分離度效果最好，最終其作為本方法的流動相。通過對苯嘧磺草胺標準物質注入質譜產(chǎn)生的碎片離子進行分析，發(fā)現(xiàn)有348.2 和328 兩個較大的離子碎片，且328 碎片響應度高且穩(wěn)定，可以選作定量離子，將響應低的348.2 碎片作為定性離子。圖1 a-c 分別為苯嘧磺草胺定性離子、定量離子、總離子流解析圖。

圖1 苯嘧磺草胺定量離子（上）、定性離子（中）和總離子流（下）圖

2.3 線性范圍、標準曲線、檢出限及定量限

用標準工作液配制成濃度為10、20、50、100、200 ng/mL 的工作曲線（圖2）。以定量離子峰面積為縱坐標，標準物質濃度為橫坐標繪制曲線。檢出限按信噪比S/N=3，定量限按信噪比S/N=10 計算。在0.01～10.0 mg/kg 范圍內苯嘧磺草胺線性關系良好，線性方程為y=24.1361x-16.0385，R=0.9996，檢出限為0.002 mg/kg，定量限為0.006 mg/kg。

圖2 苯嘧磺草胺標準曲線

2.4 不同基質中的響應度

針對常見的食品，選擇豬肉、雞蛋、蔬菜（上海青）、水果（梨）、雞蛋、牛奶分別配制基質曲線。表4 為不同食物基質中10、20、50、80、100 μg/kg 5 個濃度定量離子峰面積與溶劑基質的對比，由表4 可以看出，苯嘧磺草胺在5 種基質中的響應度與溶劑基質差異不大，雖然牛奶基質中苯嘧磺草胺整體響應度相對較低，但由圖3 可知，曲線最低濃度在牛奶基質中也能很好的定性和定量，常見的豬肉、雞蛋、蔬菜、水果、牛奶中添加10 μg/kg 苯嘧磺草胺質譜圖見圖4。從圖4中可以看出，各基質均能很好的定性和定量。綜上所述，此檢測方法能適用于上動物源性和植物源性食物中苯嘧磺草胺殘留量的檢測。

表4 不同基質基中定量離子峰面積對比

圖3 牛奶中添加10 μg/kg 苯嘧磺草胺檢測的定量離子（上）、定性離子（下）圖

圖4 不同基質中添加10 μg/kg 苯嘧磺草胺質譜圖

2.5 方法準確度實驗

在不同的植物源性食品基質和動物源性食品基質中，分別添加不同濃度的苯嘧磺草胺回收率在88.9%-110.3%之間（表5），符合檢測要求。

表5 不同基質基中三添加水平回收率對比

3 討 論

歐洲食品安全局（European Food Safty Authority，EFSA）在2012 年公布的《關于在各種食品中設立苯嘧磺草胺最大殘留限量的合理化意見》（EFSA 2012b）[4]中收集了苯嘧磺草胺的急性毒性、短期毒性等毒理學研究數(shù)據(jù)，同時設計了一系列使用試驗（針對作物）、喂養(yǎng)試驗（針對牲畜），然后檢測苯嘧磺草胺在動植物體內殘留，最后評估出苯嘧磺草胺的可接受攝入量為0.05 mg/kg 體重，急性中毒參考劑量也是同樣水平。該文件依據(jù)評估數(shù)據(jù)制定了苯嘧磺草胺在不同食品中的殘留量限值，同時還指出苯嘧磺草胺的主要代謝物為三氟乙酸（TFA），但是三氟乙酸缺乏毒理學參考數(shù)據(jù)和殘留量數(shù)據(jù)，無法進行風險評估。因此歐洲食品安全局在2014 年又發(fā)布了《不同作物中苯嘧磺草胺限值的合理化建議-基于代謝物三氟乙酸相關風險評估》（EFSA 2014b）[11]，公布了三氟乙酸的毒理學研究數(shù)據(jù)，并對哺乳動物中三氟乙酸暴露風險進行了評估，根據(jù)評估數(shù)據(jù)修改了部分食品中的苯嘧磺草胺殘留量限值。

苯嘧磺草胺是名副其實的暢銷農(nóng)藥。苯嘧磺草胺在中國的專利為2001 年申請的《尿嘧啶取代的苯基氨磺酰羧酰胺》[13]，已經(jīng)于2021 年4 月到期。脫離專利保護之后，苯嘧磺草胺在中國的產(chǎn)量和應用量有可能會大大增加。值得注意的是，國標中規(guī)定某種農(nóng)藥限量為臨時限量，一般是因為該物質沒有完整毒理學結論、膳食消費數(shù)據(jù)或沒有檢驗方法，無論是哪一種情況，對于一種正在被日益廣泛使用的農(nóng)藥來說，缺少可靠的定量檢測方法都是一個極大的隱患。

歐洲食品安全局建立的苯嘧磺草胺檢測方法，采用高效液相色譜串聯(lián)質譜，提取溶劑為甲醇水溶液（70/30, v/v）和乙腈，定量限為0.03 mg/kg（植物源性食品）和0.01 mg/kg（動物源性食品），具體的提取方法、色譜條件和質譜條件沒有披露。而此研究的方法定量限優(yōu)于歐盟方法，提取溶劑也由2 種改為1 種，前處理復雜程度和試驗成本應該也有所降低。

4 總 結

研究建立了一種液相色譜-串聯(lián)質譜測定植物源性食品中苯嘧磺草胺殘留量的方法。樣品經(jīng)乙腈超聲提取，過固相萃取柱凈化，氮吹濃縮后上機檢測。在0.01～10.0 mg/kg 范圍內線性關系良好，線性方程為y=24.1361x-16.038 5，（R=0.999 6），檢出限為0.002 mg/kg，定量限為0.006 mg/kg。方法穩(wěn)定性較好，精密度高，檢出限和定量限能夠滿足GB 2763—2021 中苯嘧磺草胺的限值要求，能夠為苯嘧磺草胺的后續(xù)研究以及監(jiān)測提供技術支撐。