HPLC-MS/MS 測定豬尿中萊克多巴胺藥物殘留的不確定度評價

劉曙光，楊彥寧，隆雪明，陳福華，匡光偉，周 燦，歐海軍

（湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南 長沙 410006）

隨著河北某縣“又見瘦肉精”事件的曝光，“瘦肉精”一詞再次出現(xiàn)在大家視野中。瘦肉精一般泛指具有相似結(jié)構(gòu)的β-腎上腺素受體激動劑（簡稱β-激動劑），能夠抑制動物脂肪生成，促進動物生長，特別對提高畜禽瘦肉比率有明顯作用。但是，β-激動劑易在動物體內(nèi)積聚殘留，并通過食物鏈進入人體，容易造成急性或慢性食肉中毒。一旦攝入量過大，對心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)具有刺激作用，會引起心悸、心慌、惡心、嘔吐、肌肉顫抖等臨床癥狀，甚至可能危及生命，嚴重危害人類健康。萊克多巴胺是一種人工合成的β-腎上腺受體激動劑（俗稱β-興奮劑）類化合物，早在2002 年，我國就明令禁止其作為獸藥和飼料添加劑在動物養(yǎng)殖中使用。

準確檢測肉品中萊克多巴胺藥物殘留不僅在保障動物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全方面有重要意義，而且有助于確保養(yǎng)殖環(huán)節(jié)依法、科學，為獸藥執(zhí)法監(jiān)管工作的有效開展提供有力的支撐。超高效液相色譜法常用于測定牛肉中食源性興奮劑類藥物殘留[1]，該研究采用HPLC-MS/MS 測定豬尿中萊克多巴胺藥物殘留，采用JJF-1059—2012 測量不確定度評定與表示[2]、JJF1135—2005 化學分析測量不確定評定[3]、CNASGL006—2019 化學分析中不確定度評估指南[4]等對其結(jié)果進行不確定度評估，對不確定度各分量進行計算，找出影響檢測結(jié)果不確定度的各種因素，為評定檢測結(jié)果的準確性提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HPLC-MS/MS（AB 4500Q Trap）：配有電噴霧離子源（ESI），固相萃取裝置，萊克多巴胺標準品（Dr），MCX 固相萃取柱（100 mg/3 mL），β-鹽酸葡萄糖苷酶/芳基硫酸酯酶、甲醇、乙酸乙酯、異丙醇、乙酸銨、氫氧化鈉、甲酸（色譜純）。

1.2 樣品制備

取5 mL 豬尿樣品于50 mL 離心管內(nèi)，加入乙酸銨緩沖液0.5 mL（2 mol/L、pH 值5.2），加入40 μLβ-鹽酸葡萄糖苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋，37℃避光水浴振蕩16 h。酶解后，添加100 μL 100 ng/mL 內(nèi)標物，渦旋，離心，pH 值調(diào)至9.8±0.2，加入10 mL 異丙醇-乙酸乙酯（6 ∶4）、1.5～2 g 固體氯化鈉飽和水相，渦旋振蕩，離心，重復提取一次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸干，用5 mL 2 mol/L 的乙酸銨溶液（pH 值5.2）溶解。MCX 柱子活化后，去備用液全部過柱，淋洗液淋洗，5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液氮氣吹干。殘余物用0.5 mL 0.1%甲酸溶解，上機分析。基質(zhì)標定量。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm 1.7 μm），柱溫為40℃；進樣體積10 μL，流速為0.3 mL/min，流動相A 乙腈，流動相B 為0.1%甲酸水溶液，梯度為0～2 min，體積分數(shù)為8%的B 溶液；2～6 min，體積分數(shù)為8%～60%的B 溶液，6～6.5 min，體積分數(shù)為60%～80%的B 溶液，6.5～7.5 min，體積分數(shù)為80%的B 溶液，7.5～8 min，體積分數(shù)為80%～8%的B 溶液。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子化模式為電噴霧正離子模式，質(zhì)譜掃描方式為MRM，離子源溫度為600℃、碰撞能量及定性定量離子質(zhì)譜參數(shù)如表1 所示。

2 不確定度分析與評定

2.1 數(shù)學模型

采用基質(zhì)外標法定量，按下式計算萊克多巴胺藥物含量：

式中：X為樣品中待測組分含量（μg/mL）；C被測樣品濃度（μg/mL）；V1溶解殘余物所得試樣溶液體積；V2試樣體積（mL）。

上述公式依據(jù)樣品測定原理給出，未考慮隨機因素對測量結(jié)果的影響。

2.2 不確定度來源

根據(jù)檢測過程萊克多巴胺含量的計算公式，得到不確定度來源圖，見圖1。

圖1 萊克多巴胺藥物檢測過程中不確定度來源

2.3 各分量標準不確定度的評估

2.3.1 測量重復性的相對標準不確定度由于分析過程中，很多操作引入的不確定度具有一定的重復性，如天平稱量，移液管轉(zhuǎn)移液體，容量瓶定容體積等操作等，因此，可以將此類分量進行歸納，引入重復性，即精密度，用于分析研究過程中隨機變化引入的不確定度。精密度主要采用統(tǒng)計學方式來進行研究，對陽性樣品中萊克多巴胺藥物含量進行一系列平行測試，得到分析過程總隨機變化，以該標準化差值的標準偏差評估試驗過程的重復性不確定度。

上述分量合并研究各種隨機因素，如體積讀數(shù)偏差、LC-MS/MS 的變動，樣品混合不均勻以及HLB固相萃取小柱對回收率的影響等，后續(xù)評定其他分量時，不再考慮各種隨機因素。

表2 豬尿中萊克多巴胺含量 （mg/L）

2.3.4 標準溶液引入的不確定度

（1）標準品純度引入的不確定度。

綜上，在標準儲備液配制時引入的不確定度由上述3 種組成，即：

2.3.5 標準曲線擬合引入不確定度人工配制濃度為1.00 mg/mL 萊克多巴胺儲備液，稀釋為0.500、1.00、2.00、5.00、10.0 ng/mL 標準系列，會引入不確定度，校正曲線為Ai=a+bCi，由工作曲線變動性引起濃度c的標準不確定度分量為：

表4 標準曲線配制過程引入的不確定度

表5 標準曲線配制過程引入的不確定度

校正曲線各個參數(shù)如表6 所示。

表6 校正曲線引入不確定度計算

2.3.6 回收率u（R）引入不確定度在空白豬尿中加入10 μg/kg 的萊克多巴胺藥物，平行測定5 次，回收率結(jié)果見表7。

表7 豬尿中萊克多巴胺加標回收率測定結(jié)果及不確定度計算

2.4 合成標準不確定度

2.4.1 相對不確定度按照評定不確定度的測量模型計算萊克多巴胺含量的合成不確定度：

本次測定，樣品中萊克多巴胺為1.015 mg/L，則u=uc(X)×X=1.015×0.015 4=0.015 6 mg/L

2.4.2 擴展不確定度根據(jù)國際慣例95%置信概率，取包含因子K=2，則擴展不確定度為u(x)=k×u=2×0.015 6=0.031 2 mg/L。

2.4.3 檢測結(jié)果的表示用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定豬尿中萊克多巴胺，結(jié)果表示為（1.015±0.031 2）mg/L，其中擴展系數(shù)為k=2。

2.5 不確定度評定

根據(jù)上述結(jié)果，制成相對不確定度直方圖（圖2）。由相對不確定度直方圖可以看出，對萊克多巴胺結(jié)果影響最大的是urel(Cs)，即標準溶液的配制、稀釋，其次是重復性操作urel(fr)及試樣的體積量取urel(V1)。

圖2 不確定度分量直方圖

3 討論與結(jié)論

不確定度的含義是指由于測量誤差的存在，對被測量值的不能肯定的程度，反過來，也表明該結(jié)果的可信賴程度。它是測量結(jié)果質(zhì)量的指標。檢測試驗結(jié)果表明，當豬尿中萊克多巴胺含量測定結(jié)果為1.015 mg/L 時，其擴展不確定度為0.031 2 mg/L（k=2），其中，引入不確定度主要的影響因素是標準品配制及稀釋、重復性操作及試樣體積量取。因此，在對豬尿中萊克多巴胺含量進行檢測時，應盡量確保標準溶液配制及稀釋精準，增加標準溶液的測定次數(shù)，同時多做平行樣，保證重復性操作的規(guī)范性，消除系統(tǒng)誤差帶來的影響，此類不確定度分量對檢測結(jié)果帶來的影響，也為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制提供有效的測量數(shù)據(jù)。