大豆和豌豆分離蛋白復合熱促凝膠特性的研究

王可堯，任仙娥，楊鋒，黃永春，張昆明，劉純友，黃承都

(廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006)

大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)營養價值高且不含膽固醇，因其具有良好的理化性質和加工特性而被充分應用于食品工業中[1-3]。豌豆分離蛋白(pea protein isolate，PPI)生物價高，富含促進人體肌肉增長的賴氨酸和可以提鮮調味的谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸[4]，其亞基組成和SPI相似，且不含過敏原，但因PPI功能性較SPI差，且SPI在植物蛋白中優勢較多，其在食品領域中利用率低[5]，因此考慮在PPI中添加有較好功能特性的SPI，制備出一種低脂、低膽固醇和高營養價值的SPI和PPI復合熱促凝膠。熱促凝膠的形成大致分為三步:首先,在一定強度的熱處理后，蛋白分子間共價鍵或次級鍵遭到破壞，亞基逐漸去折疊，功能基團暴露；其次,蛋白分子間彼此靠近，通過分子間相互作用發生聚集；最后,聚集的蛋白相互交聯形成凝膠網絡結構[6]。

SPI和PPI作為植物蛋白中應用最為廣泛的兩種蛋白質，將兩者共混應用于植物基食品的開發中有利于提高食品的總營養價值，為消費者提供健康新選擇。本文以植物混合蛋白凝膠為模型研究不同蛋白濃度和不同比例下(11%、14%、17%)復合SPI和PPI熱促凝膠特性，利用流變儀模擬凝膠形成的全過程，利用質構儀測定其成膠強度，通過凝膠的持水率結果來判斷凝膠網絡結構的優良程度。研究在17%濃度下復合熱促凝膠的分子間作用力大小和類型，探索凝膠結構性質差異的原因，最后利用掃描電子顯微鏡來觀察其微觀結構差異，從而為設計植物基食品的結構和功能提供理論指導，為開發新類型不同種類植物基食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(蛋白含量≥90%)：山東禹王生態實業有限公司；豌豆分離蛋白(蛋白含量≥80%)：煙臺雙塔食品股份有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

MCR 72旋轉流變儀 奧地利Anton Paar有限公司；TA-XT Plus質構分析儀 英國Stable Micro System公司；JXN-26高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特股份有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司；LGJ-10D臺式冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司；Phenom ProX掃描電子顯微鏡 上海復納科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 復合凝膠流變學分析

配制蛋白濃度分別為11%、14%、17%，蛋白質比例(SPI和PPI的比例)分別為1∶0、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1的SPI和PPI混合蛋白溶液，使用2 mol/L HCl或NaOH溶液調節pH至8.0，磁力攪拌2 h，使其充分溶解。

采用旋轉流變儀模擬凝膠形成全過程。選用PP50平行板(直徑50 mm；間隙值1 mm)，上樣后刮除多余液體，在轉子四周滴加硅油以防止溫度過高使水分蒸發。整個過程中溫度掃描參數為：1 Hz和應變0.5%，以2 ℃/min的速度從25 ℃升高至95 ℃，然后在95 ℃下保溫30 min，再以2 ℃/min的速度降溫至25 ℃，記錄儲能模量(G′)和損耗模量(G″)隨時間和溫度的變化情況[7]。

1.3.2 復合熱促凝膠的制備

將上述配制好的混合蛋白溶液分裝至玻璃瓶中，封上蓋子，于恒溫水浴鍋中95 ℃熱處理30 min，冰水浴冷卻到室溫后，于4 ℃過夜保存，測試前需于室溫下放置30 min。

1.3.3 復合凝膠強度的測定

利用TA-XT Plus質構分析儀對制得的凝膠樣品進行凝膠強度測定。條件設定為：探頭類型P/0.5；測試前速度5.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s和測試后速度5.0 mm/s；觸發力為3 g。探頭下壓至10 mm時出現的最大的力定義為凝膠強度。

1.3.4 復合凝膠持水率的測定

稱取約5 g復合凝膠樣品裝入10 mL離心管中，以轉速10000 r/min離心10 min，用濾紙小心吸出離心后樣品瀝出的水分，稱取重量，持水率計算公式為：

式中：W1為樣品質量(g)，A為蛋白濃度，W2為樣品瀝出水分后的質量(g)。

1.3.5 復合凝膠分子間作用力的測定

參照Tanger等[8]的測定方法，并稍作調整。用大蒜壓榨器將蛋白濃度為17%的復合凝膠樣品壓碎，分別稱取0.5 g樣品于三角燒瓶中，加入20 mL S1(0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 7.5)，置于恒溫搖床中振蕩1 h使其充分溶解，于10000 r/min離心15 min得上清液；取沉淀加入20 mL S2(0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液+2 g/L SDS，pH 7.5)振蕩、離心后得上清液；再取沉淀加入20 mL S3(0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液+2 g/L SDS+15 g/L二硫蘇糖醇，pH 7.5)振蕩、離心后得上清液，向上述各步離心后所得上清液中加入20 mL 20 g/dL的三氯乙酸，離心取沉淀加入1 mol NaOH溶解，離心得上清液，采用福林酚比色法測定其可溶性蛋白質含量。溶解于S1的蛋白質含量代表靜電作用的貢獻，溶解于S2的蛋白質含量代表疏水相互作用的貢獻，溶解于S3的蛋白質含量代表二硫鍵的貢獻。

1.3.6 凝膠微觀結構的觀察

將17%的復合凝膠樣品冷凍干燥后取小塊顆粒，使用導電雙面膠將其固定在樣品臺上，通過離子濺射噴金處理，噴金時間為20 s。噴金結束后，將樣品臺放入掃描電子顯微鏡后對凝膠微觀形態結構進行觀察記錄。測試條件為加速電壓10 kV，放大倍數300倍。

1.3.7 數據分析

文中實驗數據均重復3組，每組至少3個平行。通過SPSS 22.0軟件Duncan檢驗法進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，實驗結果以平均數±標準差的形式表示，圖片通過Origin 8.0軟件制作。

2 結果與分析

2.1 復合凝膠流變學性質

儲能模量G′代表固體性質，與凝膠彈性有關；損耗模量G″代表液體性質，與凝膠黏性相關[9]。11%、14%和17%濃度下不同蛋白比例的SPI和PPI復合蛋白熱促凝膠形成曲線隨時間和溫度的變化情況見圖1。

圖1 SPI與PPI復合凝膠流變學

由圖1可知，在升溫-保溫-降溫的熱循環過程中，復合蛋白的G′和G″變化趨勢基本一致。

在11%、14%和17%濃度下，SPI和PPI的比例為1∶0和3∶1時，以及在14%和17%濃度下，SPI和PPI的比例為1∶1時，復合凝膠的G′值始終大于G″值，且在升溫過程中，G′和G″表現為先下降后上升的趨勢，此過程包括凝膠形成、凝膠消弱和凝膠提高3個階段[10]。由于SPI黏度大，一開始G′值就大于G″值，表現出固體性質。隨著溫度的升高，蛋白質與蛋白質之間和蛋白質與水之間的氫鍵斷裂，體系的黏度下降，因此，G′值和G″值隨溫度的增加反而不斷下降。PPI的變性溫度大約在75～85 ℃，而SPI的變性溫度在85～95 ℃，在保溫階段，95 ℃已達到SPI和PPI完全失活溫度，復合蛋白的高級結構被破壞，蛋白質內部的疏水性基團、巰基、二硫鍵等基團暴露，蛋白分子間交聯聚集轉變為更加有序的凝膠網絡結構，G′值和G″值持續增加。在降溫階段，隨著溫度的下降，凝膠結構G′值和G″值持續增加，凝膠網絡結構進一步穩固。

在11%濃度下，SPI和PPI蛋白比例為1∶1時，在14%濃度下，蛋白比例為1∶3時，以及在17%濃度下，蛋白比例為1∶3和0∶1時，體系初始的G′小于G″，這可能是因為隨著豌豆蛋白比例的增加，體系的黏度降低。隨著溫度的升高，G′增加的速度大于G″，G′和G″出現交點，標志著三維網絡開始建立，此時的溫度和時間被稱為成膠溫度和成膠時間。隨后，G′開始大于G″，蛋白分子間發生聚集交聯，模量增加，凝膠網絡結構不斷加強，在該階段二硫鍵促進分子間重排，形成穩固的凝膠結構。在降溫階段，凝膠網絡結構主要由氫鍵來維持，較低溫度下有利于氫鍵的形成，G′和G″持續增加。

在11%濃度下，當SPI和PPI蛋白比例為1∶3和0∶1時，以及在14%濃度下，蛋白比例為0∶1時，G″值一直處于大于G′值的狀態，凝膠未形成，此時的濃度未達到形成凝膠的濃度。在不同濃度下，隨著蛋白濃度的增加，同一比例下最終形成凝膠的儲能模量值不斷增加。在不同的比例下，隨著PPI的增加，最終形成凝膠的儲能模量值不斷下降，這可能是由于PPI稀釋了有較強SPI凝膠的G′值，說明SPI凝膠樣品相比PPI凝膠具有較高的類固體性質，因此可通過調控不同的SPI和PPI濃度及比例，降低PPI的成膠濃度。

2.2 復合凝膠強度的測定

分析不同蛋白濃度下SPI和PPI以不同比例混合形成的復合熱促凝膠強度，結果見表1。

表1 SPI 與PPI復合熱促凝膠強度(g)

由表1可知，隨著蛋白濃度的增加，凝膠強度顯著升高(P<0.05)；同一濃度下，隨著PPI比例的增加，凝膠強度顯著下降(P<0.05)。蛋白濃度是熱促凝膠形成的決定性因素之一[11]，蛋白濃度越高，凝膠強度越大，其原因主要是隨著蛋白濃度的增加，熱誘導可暴露更多的活性基團數目，提高了蛋白分子間交聯聚集的機會，因此形成了更致密的凝膠網絡結構，凝膠強度也隨之增大[12]，這與流變最終的儲能模量測定結果一致。對于SPI，僅通過熱處理方式自發形成凝膠的蛋白臨界濃度為8%，而對于PPI，形成凝膠所需的最低蛋白濃度為16%[13]，當低于最低成膠蛋白濃度時，蛋白樣品僅靠加熱的方式無法形成凝膠。因此，當蛋白濃度為11%、SPI和PPI蛋白比例為1∶3和0∶1時，以及蛋白濃度為14%、SPI和PPI蛋白比例為0∶1時，復合蛋白不能通過熱處理自發成膠。當復合蛋白濃度為17%時，均能形成熱不可逆的凝膠樣品。此外，在不同比例下，由于PPI含硫氨基酸含量較SPI少[14]，SPI對復合體系凝膠強度起主要作用，隨著PPI添加量的增大，稀釋了有較強凝膠特性的SPI，凝膠強度不斷降低。

2.3 復合凝膠持水率分析

持水率是指蛋白凝膠網絡有效固定水分子的能力強弱，是反映凝膠網絡優良的重要指標[15]。不同蛋白比例和蛋白濃度下復合熱促凝膠的持水率見表2。

表2 SPI與PPI復合熱促凝膠持水率(%)

由表2可知，隨著蛋白濃度的增加，凝膠持水率變化趨勢與儲能模量、凝膠強度結果一致，說明蛋白濃度的增加使蛋白分子間交聯密切，有利于形成致密的凝膠網絡結構，而凝膠網絡結構越致密、有序，持水率越高。單一SPI凝膠在11%、14%和17%濃度下和復合SPI和PPI在蛋白濃度為14%和17%、蛋白比例為3∶1時，持水率均接近100%，說明在高濃度下SPI和少量添加PPI形成的凝膠結構十分致密，在高速離心力作用下不受破壞，幾乎沒有水分滲出。隨著PPI比例的持續增加，復合凝膠持水率顯著降低(P<0.05)。一方面可能是由于PPI的溶解度低于SPI[16]，PPI在形成凝膠網絡時不易更好地結合水分子，因此持水率下降。另一方面，PPI比SPI含硫氨基酸含量少，形成的凝膠強度低，因此凝膠結構持水率低于SPI。

2.4 復合凝膠形成的分子間作用力分析

形成和維持蛋白質熱促凝膠的主要作用力包括靜電作用、疏水相互作用等非共價鍵和二硫共價鍵[17]，分子間作用力的大小、類型不同凝膠結構性質也會有所差異[18]。通過添加不同的變性劑，采用逐步溶解的方法，測得上清液中蛋白質的溶解性大小，可間接反映維持凝膠穩定的靜電作用、疏水相互作用和二硫鍵大小[19]。17%蛋白濃度下復合凝膠形成的分子間作用力結果見圖2。

圖2 SPI與PPI復合凝膠分子間作用力

由圖2可知，靜電作用隨著PPI蛋白比例的增高而顯著升高(P<0.05)；疏水相互作用先升高后降低，在SPI和PPI的比例為1∶3時達到最大；二硫鍵顯著降低(P<0.05)。在熱誘導中，二硫鍵是維持SPI凝膠網絡結構的主要作用力，靜電作用和疏水相互作用對維持PPI凝膠網絡貢獻較大，因此SPI形成的凝膠結構較PPI更為穩固。靜電作用隨著PPI含量的增加不斷增大，在pH 8.0實驗條件下，pH遠離SPI和PPI蛋白等電點，蛋白質表面帶有大量的凈負電荷，此時靜電斥力占主導，蛋白質間難以聚集成膠，當靜電斥力與吸引力主要是疏水相互作用達到平衡時，才有可能形成凝膠網絡結構，而當引力大于斥力時，形成高度脫水收縮的不透明凝膠結構。在熱處理過程中，蛋白質分子結構打開，疏水基團暴露，疏水相互作用增強，隨著PPI比例的增加，疏水相互作用顯著增高(P<0.05)，可能是由于PPI中疏水性氨基酸的含量高于SPI[20]，但單一PPI蛋白凝膠疏水相互作用略有降低，可能是由于95 ℃遠高于PPI的變性溫度，蛋白聚集程度增高，一部分的疏水基團因聚集作用重新被包埋在蛋白分子內，導致疏水相互作用有所降低。二硫鍵是形成蛋白凝膠網絡結構的主要作用力，二硫鍵隨著PPI含量的增加不斷降低，可能是由于PPI含硫氨基酸含量小于SPI，此結果導致PPI凝膠儲能模量、硬度和持水率均小于SPI。

2.5 復合凝膠的微觀結構

利用掃描電子顯微鏡對17%蛋白濃度下凝膠微觀結構進行分析，結果見圖3。

圖3 SPI與PPI復合凝膠微觀結構

由圖3可知，不同比例下凝膠的微觀結構有較大的差異。SPI凝膠表面質密、孔洞均勻，蛋白質分子間從各個角度進行交聯，相互交織，形成穩固的結構。當SPI和PPI的比例為3∶1時，凝膠孔徑變大，說明少量PPI的加入導致SPI凝膠網絡結構變差。當SPI和PPI的比例為1∶0和3∶1時，凝膠微觀結構立體感更強，可能導致凝膠強度、持水率更好。隨著PPI組分的增加，凝膠結構越趨于片層狀，形成不規則的斷層，使總體結構顯得粗糙。分析不同比例下凝膠微觀結構差異的原因，可能是隨著PPI比例的增加，維持凝膠分子間作用力的不同，主要是二硫鍵含量的減少，導致凝膠質地變差。

3 結果與討論

本文以SPI和PPI為原料，通過對11%、14%和17%濃度下復合熱促凝膠特性的研究發現，蛋白濃度越高，儲能模量、凝膠強度和持水率越高。同時，兩種植物蛋白的凝膠性差異較大，隨著PPI比例的增加，復合蛋白最終形成凝膠的儲能模量、凝膠強度和持水率呈不斷下降的趨勢，形成的凝膠網絡結構質地越來越松散、零碎，蛋白間交聯度減弱，凝膠性能逐漸變差。分析復合熱促凝膠分子間作用力發現疏水相互作用和二硫鍵對SPI凝膠貢獻較大，靜電作用和疏水相互作用對PPI凝膠貢獻較大，分子間作用力的類型不同暗示著SPI和PPI凝膠性能不盡相同，因此通過在PPI中添加SPI可提高PPI的凝膠特性，提高PPI在食品工業中的利用率，同時也為不同植物基蛋白產品的復配研究提供了理論依據。