豆豉兔丁在貯藏過程中揮發性風味成分測定及其動態分析

袁波，張佳敏*，王衛，白婷，翁德暉，向聰，楊浩

(1.成都大學肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106；2.四川高金實業集團股份有限公司，四川 遂寧 629000；3.成都大學 食品與生物工程學院，成都 610106)

近年來，隨著川菜工業化的興起，川菜菜肴成為研究熱點，如東坡肘子、回鍋肉[1]、咸燒白[2]、魚香肉絲[3]等已實現工業化生產。兔類菜肴如豆豉兔丁、陳皮兔丁[4]、香辣兔丁[5]、麻油兔丁[6]等冷吃類菜肴工業化發展迅速。豆豉兔丁作為四川特色美食菜肴之一，以鮮兔肉、豆豉作為主要食材，搭配油、鹽、辣椒、糖、香辛料等輔料，經油炸、煸炒等工序烹飪而成，具有味道鮮香可口、麻辣味厚、咸味適中、色澤光亮、香氣迷人等特點，受到消費者的喜愛。風味作為菜肴重要的評價指標，目前對兔肉菜肴風味研究多側重于加工工藝方面，如Siddique等[7]研究了不同烹飪方法對兔肉中多環芳烴的影響；李韜等[8]研究發現添加40%的香菇可改進冷吃兔的風味物質組成；李曉燕等[9]通過添加香菇柄改善兔肉松產品的風味。現有的研究主要集中于對加工階段的風味提升和工藝改良，對豆豉兔丁貯藏過程中風味變化規律的研究較少。但作為工業化菜肴產品，在后期貯藏過程中，產品的風味會受貯藏條件、貯藏時間等因素的影響而逐漸衰減，摸清菜肴風味衰減規律對于工業化菜肴產品的保質保鮮具有重要意義。

本實驗以肉類加工四川省重點實驗室研究開發的豆豉兔丁菜肴工藝為基礎，利用固相微萃取結合氣相色譜-質譜技術測定低溫和常溫兩種貯藏方式條件下產品在貯藏期間的揮發性風味成分，并對其進行主成分分析研究，以期為豆豉兔丁菜肴的后期貯藏保鮮、提升產品品質、安全性提供一定的數據理論依據，推動其工業化進程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：豆豉兔丁菜肴，由肉類加工四川省重點實驗室研究開發并提供。

試劑：正構烷烴(分析純)，購自四川科龍化工有限公司。

1.2 儀器與設備

Testo 205 pH型計 德國儀表(深圳)有限公司；5977A-7890B型氣相色譜-質譜聯用儀(含PAL3自動進樣器) 美國安捷倫公司；BCD-452WDPF型冷藏冰箱 青島海爾集團。

1.3 實驗方法

1.3.1 揮發性風味物質測定

前處理條件：取3 g粉碎后的樣品于15 mL頂空瓶中密封，設置CTC自動進樣器對樣品的前處理條件如下：加熱箱溫度75 ℃，加熱時間35 min，樣品抽取時間20 min，解吸時間5 min。

GC條件：HP-5MS UI色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；壓力32.0 kPa；流速1.0 mL/min；載氣為He，不分流進樣；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持4 min，以3 ℃/min升至85 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min升至150 ℃，保持 2 min，再以20 ℃/min升至230 ℃。

MS條件：電子電離源(EI)；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃；檢測器電壓350 V；質量掃描范圍(m/z)：40～500。

定性：對化合物進行分析時，將得到的數據在儀器的NIST 14.L譜庫中進行檢索和匹配，選擇匹配度高于80%的物質。

定量：對總離子流色譜圖用峰面積歸一化定量，得出各組分的相對含量。

產品指標在第1天、第15天、第30天、第60天、第90天、第120天測定。

1.3.2 關鍵揮發性風味物質評價

在揮發性風味成分的相對含量(%)統計分析基礎上，結合ROAV法對常溫、低溫貯藏豆豉兔丁貯藏期間的關鍵揮發性風味物質進行分析評價，最終明確其關鍵性風味物質[10]。 采用ROAV法評價各揮發性成分對樣品風味的貢獻：對樣品風味貢獻程度最大的物質ROAVs=100，定義其他物質ROAV計算公式如下：

式中：ROAVi為某揮發性成分的相對氣味活度值；Ci為某揮發性成分的相對含量；Ti為某揮發性成分的香氣閾值；Tstan為風味貢獻程度最大物質的香氣閾值；Cstan為風味貢獻程度最大物質的相對含量。

所有組分：0≤ROAV≤100時，ROAV值越大則表示該物質對樣品風味的貢獻越大；ROAV≥1時，對樣品風味的貢獻顯著，即為該樣品的關鍵揮發性風味物質；0.1≤ROAV<1時，對樣品風味有一定程度修飾作用。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2019進行數據統計，采用SPSS 24.0軟件進行主成分分析，采用Origin 2017 64 Bit作圖，采用TBTools軟件進行層次聚類分析并作熱圖。

2 結果與分析

2.1 揮發性風味成分測定統計分析

兩種貯藏條件下豆豉兔丁菜肴貯藏期各類揮發性風味化合物相對含量統計表見表1，種類堆積圖見圖1。

圖1 各類揮發性風味化合物種類堆積圖

表1 各類揮發性風味化合物成分相對含量統計表

續 表

由表1可知，隨著貯藏期延長，LT組和NT組中各類化合物相對含量變化規律存在差異，LT組中醇類、酯類和酚類等化合物呈先升后降的趨勢，酮類化合物呈降低趨勢，醛類、酸類、烴類和醚類化合物變化不規律，其他化合物有增大趨勢；NT組中酸類化合物呈先升后降的趨勢，醇類、醛類、酯類、烴類、酮類、酚類和醚類等化合物變化不規律，其他化合物有增大趨勢。LT組和NT組的總揮發性風味化合物種數均呈先升后降的趨勢，即1 d(55，54種)、15 d(65，56種)、30 d(91，80種)、60 d(79，75種)、90 d(28，20種)、120 d(25，19種)，且低溫組更多。這與蛋白質、脂質等物質在貯藏期間受殘留氧、光照、自由基團、溫度等因素進行自動氧化水解反應以及其他生化反應進程密切相關[11-12]。

2.2 揮發性風味成分的 ROAV 分析

由表2可知，在貯藏1～120 d，LT組和NT組中共有67種具有感官閾值的揮發性風味成分，其中醇類13種、醛類18種、酸類6種、酯類4種、烴類12種、酚類5、醚類2種、酮類4種、其他類3種。在貯藏120 d期間，LT組和NT組中共確定17種關鍵揮發性風味成分(ROAV≥1)，LT組和NT組分別為16種和14種，其中醛類(反式-2,4-癸二烯醛(B17)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(B6)、反式-2-癸烯醛(B15)、壬醛(B10)、苯乙醛(B8)、己醛(B1)、癸醛(B2)、庚醛(B3))、醇類(芳樟醇(A6)、桉葉油醇(A5))、蒎烯(E3)、茴香腦(G2)、二烯丙基二硫(I3)為LT組和NT組共有的關鍵揮發性風味物質；1-壬烯-3-醇(A4)、反-2-辛烯醛(B9)和檸檬醛(B16)為LT組特有，1-辛烯-3-醇(A3)為B組特有。且LT組和NT組中關鍵風味成分種類隨著貯藏期的延長呈現先升后降的趨勢，在1，15，30，60，90，120 d各貯藏期間分別為5，4，9，11，10，8種和4，5，11，11，7，7種。

表2 貯藏期揮發性風味物質相對氣味活度值

續 表

續 表

由圖2可知，各類風味物質可分為兩類，第一類包含醛類、醇類、烴類、醚類和其他類化合物，另一類包含酮類、酚類、酸類和酯類。各貯藏期間的特征性物質存在差異，其中LT-1 d、LT-15 d、LT-60 d和NT-1 d間各類揮發性風味物質無顯著差異，NT-15 d以酸類為主，LT-30 d以酚類、酮類為主，NT-30 d和NT-60 d以酯類和酮類為主，NT-90 d和NT-120 d以醚類、烴類、醇類和其他類為主，LT-90 d以醛類為主，LT-120 d以醛類、其他類為主。LT組相較NT組有明顯滯后現象，表明低溫可延緩揮發性風味物質的衰減，提升菜肴品質。

圖2 各類揮發性風味物質種類ROAV熱圖

2.3 關鍵揮發性風味成分主成分(PCA)分析

對LT組和NT組豆豉兔丁菜肴貯藏過程中17種關鍵揮發性風味物質(ROAV≥1)進行主成分分析，提取3個固定因子，各主成分特征值及累計貢獻率結果見表3。表3表明前3個主成分提取了17種關鍵揮發性物質的84.25%的信息，已經包含大部分信息(80%)。

表3 主成分特征值及累計貢獻率

由圖3中A-1和A-2可知，兩種貯藏條件下豆豉兔丁各貯藏期間樣品間存在顯著差異，其得分點總體按第三象限→第二象限→第一象限→第四象限順序移動。LT-1 d、LT-15 d和NT-1 d、NT-15 d樣品得分無顯著差異，表明在貯藏1～15 d樣品各物質間反應較穩定，風味物質組成和含量變化較低；在貯藏30～60 d，LT組和NT組的樣品得分點間距逐漸變大，表明各物質間反應逐漸加快，風味物質組成及含量變化加劇；在貯藏60～90 d，LT組和NT組的樣品得分點間距繼續增大，表明風味物質間反應更加頻繁，各物質組成及含量變化幅度更大；在貯藏90 d之后，LT組和NT組得分點間距均變小，LT組降幅較低，說明揮發性風味物質開始趨于穩定。此外，LT組相對NT組有明顯滯后現象，表明低溫可抑制揮發性風味物質衰減，提升豆豉兔丁菜肴貯藏品質。

圖3 關鍵揮發風味物質各貯藏期間主成分得分圖及載荷圖

由圖3中B-1和B-2可知，3個主成分共有13種載荷系數大于0.8的關鍵揮發性風味物質，其中PC1中有7種高度相關的關鍵揮發性風味物質，分別為桉葉油醇(0.937)、芳樟醇(0.967)、苯乙醛(0.944)、壬醛(0.961)、蒎烯(0.945)、茴香腦(0.945)、二烯丙基二硫(0.938)；PC2中有3種關鍵揮發性風味物質，分別為己醛(0.887)、庚醛(0.885)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(0.968)；PC3中有1-壬烯-3-醇(0.918)、反-2-辛烯醛(0.914)、反式-2-癸烯醛(0.968)3種高度相關的關鍵揮發性風味物質。其他物質載荷系數均小于0.8，表明與3個主成分的相關性不大。

2.4 關鍵揮發性風味物質層次聚類分析

將13種與主成分1、主成分2、主成分3有高度相關性的關鍵風味成分進行層次聚類分析，其熱圖見圖4，可將不同貯藏條件各貯藏過程分為6類，LT-1 d、LT-15 d和NT-1 d、NT-15 d聚成1類，NT-30 d、NT-60 d聚成1類，LT-30 d、LT-60 d聚成1類，NT-90 d、NT-120 d聚成1類，LT-90 d和LT-120 d可各成1類。結合圖3中A、B對應情況，LT-1 d、LT-15 d和NT-1 d、NT-15 d分別落于A-1的第三象限和A-2的第二象限，僅存在反式-2-癸烯醛處于A-2的第二象限且載荷系數均大于0.8，因此反式-2-癸烯醛為其特征性揮發性風味物質，具有油脂香氣[13]；NT-30 d、NT-60 d分別落于A-1的第二象限和A-2的第三象限，主要以(E,E)-2,4-壬二烯醛、己醛和庚醛為特征風味物質，均與脂質氧化產物有關[14]，與主成分2成分高度相關，其中(E,E)-2,4-壬二烯醛呈油炸風味[15]，己醛衍生自亞油酸氧化，具有令人不適的酸敗味及兔肉腥味[16-17]，庚醛是n-6和n-9多不飽和脂肪酸的氧化產物，具有油炸肉香味[18-19]；LT-30 d、LT-60 d落于A-1和A-2的第二象限，主要以己醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛和1-壬烯-3-醇和庚醛為特征風味物質，其中1-壬烯-3-醇呈蘑菇香味[20]；LT-90 d落于A-1和A-2的第一象限，主要以 1-壬烯-3-醇、反-2-辛烯醛、反式-2-癸烯醛為特征風味物質，與主成分3高度相關，其中反-2-辛烯醛是脂肪氧化的重要產物，對美拉德風味物質有影響，具有油脂香味[21]；NT-90 d、NT-120 d落于A-1和A-2的第四象限，主要以主要以桉葉油醇、芳樟醇、苯乙醛、壬醛、蒎烯、茴香腦、二烯丙基二硫為特征風味物質，與主成分1高度相關，其中桉葉油醇具有草藥香，芳樟醇為辛香[22]、苯乙醛來源于蛋白水解和氨基酸降解，呈芳香味[23]，壬醛呈酯香味[24]，蒎烯、茴香腦和二烯丙基二硫均來源于添加的香辛輔料，具有特殊香味[25]；LT-120 d落于A-1和A-2的第四象限，主要以芳樟醇、苯乙醛、壬醛、蒎烯、茴香腦、二烯丙基二硫為特征風味物質。

圖4 特征性揮發性風味物質ROAV值熱圖

3 結論

本實驗對常溫和低溫兩種貯藏條件下豆豉兔丁貯藏過程中揮發性風味成分進行測定。實驗結果表明，隨著貯藏期延長，揮發性風味成分的種數均呈先升后降的趨勢；根據ROAV法分析，共確定17種關鍵風味物質(ROAV>1)，分別為反式-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、反式-2-癸烯醛、壬醛、苯乙醛、己醛、癸醛、庚醛、芳樟醇、桉葉油醇、蒎烯、茴香腦、二烯丙基二硫、1-壬烯-3-醇、反-2-辛烯醛、檸檬醛和1-辛烯-3-醇；主成分分析顯示，3個主成分共有13種關鍵揮發性風味物質被確定為不同貯藏期間的特征性風味物質，其中PC1有7種(桉葉油醇、芳樟醇、苯乙醛、壬醛、蒎烯、茴香腦、二烯丙基二硫)、PC2有3種(己醛、庚醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛)；PC3有3種(1-壬烯-3-醇、反-2-辛烯醛、反式-2-癸烯醛)。整體而言，豆豉兔丁貯藏期間揮發性風味物質呈現逐漸衰減的趨勢，但與常溫貯藏組相比，低溫貯藏組的總體揮發性風味物質衰減明顯滯后，更有利于延長菜肴風味的保持。