耐鹽生香酵母凍干菌劑的制備及其在芫根腌菜中的應用研究

董平，易宇文，唐紅梅，程利思，蒲慧，吳華昌，鄧靜*

(1.四川旅游學院 食品學院，成都 610100；2.四川省雅士科技有限公司，成都 610042)

生香酵母是一類能夠合成令人愉悅的香氣成分的酵母，在發(fā)酵過程中可以產生酯、醇、醛、酚、酮、有機酸以及芳香烴類等香味物質，對發(fā)酵食品特殊風味與質地的形成具有重要作用。研究表明，在各類酒、調味品、發(fā)酵蔬菜、功能飲料等食品發(fā)酵過程中加入生香酵母能夠顯著提升發(fā)酵產品的風味[1-3]。然而生香酵母在長期培養(yǎng)過程中往往會因分裂次數過多而退化，并增加污染的概率[4]。因此，將具有優(yōu)良性狀的生香酵母制備成活性酵母凍干菌劑可以有效避免上述問題。同時，酵母凍干菌劑還具有使用安全、穩(wěn)定性高、長期儲存不失活等優(yōu)點[5-6]。

真空冷凍干燥技術是制備微生物活性菌劑最常用的方法，通過將菌懸液預冷凍、升華干燥、解吸干燥幾個步驟去除水分，達到干燥的目的[7]，目前在酵母[8-9]、乳酸菌[10-11]以及復合菌種[12-13]凍干菌劑的制備過程中普遍使用真空冷凍干燥技術。然而冷凍干燥過程往往會引起細胞膜通透性改變、蛋白質變性失活以及DNA損傷，從而對微生物有一定的傷害甚至導致其死亡，影響細胞存活率[14]。為了減少冷凍干燥對微生物的不良影響，通常會在菌劑制備過程中添加冷凍保護劑，如王憲斌等[15]在酵母凍干菌劑制備過程中以葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、脫脂奶粉以及谷氨酸鈉作為保護劑，發(fā)現每種保護劑都能不同程度地增加酵母的凍干存活率，并通過正交試驗優(yōu)化明確了使用5%海藻糖∶9%乳糖∶9%蔗糖為3∶5∶4的復配保護劑，酵母的存活率最高，為85.17%，說明這些保護劑對冷凍干燥過程中的酵母具有一定的保護作用，且復配保護劑的保護效果優(yōu)于單一保護劑。此外，甘油、葡聚糖、吐溫80、可溶性淀粉等也能夠顯著提高微生物的冷凍存活率[16]。然而冷凍保護劑種類繁多，不同保護劑針對不同微生物的保護效果也有差異，且往往要考慮保護劑的價格。綜合多種因素，選擇合適的保護劑才能盡可能提高微生物的冷凍存活率[17]。

芫根(BrassicarapaL.)在高海拔地區(qū)廣泛種植，是藏民最主要的蔬菜來源。芫根不僅營養(yǎng)豐富，還具有多種保健功效[18]。近年來，有研究者將芫根經鹽腌、自然發(fā)酵后制成腌菜[19]，風味獨特，口感爽脆，不僅延長了芫根的儲藏期，而且豐富了芫根相關產品。然而自然發(fā)酵的蔬菜往往產品質量不穩(wěn)定[20]，且風味也需要進一步提升。因此，進一步增加芫根腌菜的產品穩(wěn)定性，提高產品風味是目前亟需解決的問題。

本實驗將前期從川南腌菜中分離得到的耐鹽生香酵母YC14經過增殖培養(yǎng)，從離心條件、保護劑兩個方面入手，以酵母存活率為指標，確定活性酵母凍干菌劑最優(yōu)離心條件及最佳保護劑配方，明確真空冷凍干燥對YC14產酯能力的影響。同時將自制YC14凍干菌劑應用于芫根的發(fā)酵，探究耐鹽生香酵母在腌菜發(fā)酵中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

自篩耐鹽生香酵母菌株YC14 (Candidaparapsilosis)：由實驗室前期分離并保存；新鮮芫根：購自四川白玉縣；葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、吐溫80、蛋白胨、Vc、酵母膏、PDA培養(yǎng)基：購自成都金山化學試劑有限公司；海藻糖：購自上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司；谷氨酸鈉：購自上海源葉生物科技有限公司。

產酯培養(yǎng)基：葡萄糖8 g，酵母膏1 g，蛋白胨2 g，蒸餾水100 mL。

FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Universal 320冷凍離心機 德國Hettich公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化與酵母培養(yǎng)液的制備

挑取酵母培養(yǎng)物置于YPD培養(yǎng)基中活化，活化后的菌株接種至PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)20 h制得酵母培養(yǎng)液。

1.2.2 菌體離心分離條件研究

根據文獻報道[21]，取10 mL酵母培養(yǎng)液裝入已滅菌的離心管中，在4 ℃下分別以轉速1500，3000，4500，6000 r/min，離心時間3，5，10，15 min的條件進行離心，收集離心后的菌體，以離心存活率為指標，探究離心條件對菌株YC14的影響，以期選擇合適的離心條件。

離心活菌率的計算方式參照文獻[15]。

1.2.3 真空冷凍干燥菌劑的制備流程

菌種增殖培養(yǎng)→離心分離→菌體洗滌→添加保護劑→分裝至培養(yǎng)皿→預凍→真空冷凍干燥→成品低溫密封保存[22]。

1.2.4 保護劑的選擇

1.2.4.1 凍干菌劑的制備

選擇蔗糖、海藻糖、乳糖、脫脂乳粉、甘油、吐溫80、谷氨酸鈉、Vc 8種凍干保護劑。試驗前各保護劑按質量濃度配制成相應濃度的水溶液，用0.22 μm的微孔濾膜對各保護劑過濾備用。將酵母離心后得到的菌泥與保護劑按1∶2的比例混勻制成菌懸液。取2 mL菌懸液分別裝入無菌帶塞的凍干瓶中。將上述保護劑與菌體混合物平衡30 min，于-30 ℃預凍12 h。預凍完成后，轉移至真空冷凍干燥機中凍干，條件為：-37 ℃，真空度18 Pa，時間12 h。凍干樣品置于-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩φ諛犹砑油润w積無菌水。以凍干存活率為檢測指標，確定最佳凍干保護劑。

凍干活菌率的計算方式參照文獻[15]。

1.2.4.2 保護劑的單因素試驗

8種冷凍保護劑在單因素試驗中所采用的濃度梯度見表1。

1.2.4.3 復配保護劑響應面優(yōu)化試驗

綜合考慮單因素方差分析結果、凍干保護劑協同增效途徑及各保護劑成本等方面因素，選取乳糖、脫脂乳粉、吐溫80 3種保護劑，利用響應面試驗設計方法進行復配保護劑配方探究，見表2。

表2 Box-Behnken Design試驗因素與水平表

1.2.5 總酯的測定

取0.1 g凍干菌劑溶于100 mL無菌水，取1 mL加入50 mL產酯培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)；取2.2 mL酵母培養(yǎng)液，加入50 mL產酯培養(yǎng)基，在同樣的條件進行培養(yǎng)。收集2～7 d的產酯培養(yǎng)基，采用皂化回流法檢測總酯含量[23]。

1.2.6 酵母凍干菌劑應用于腌菜發(fā)酵的研究

1.2.6.1 芫根腌菜的制作

預處理：將新鮮芫根洗凈并去除頭尾，切成后0.5 cm3的芫根丁，晾曬2 d。

腌漬：在晾曬后的芫根丁中按比例添加9%的食鹽，拌勻裝壇，腌漬7 d。

發(fā)酵：將腌漬后的芫根丁脫水，按0.05%的比例接種酵母凍干菌劑，或接入相同數量的YC14活酵母，空白組不接種。將接種拌料后的芫根丁裝入消毒后的發(fā)酵罐中，置于自然環(huán)境(冬日，平均溫度14 ℃左右)與28 ℃的恒溫環(huán)境中發(fā)酵30 d，發(fā)酵過程中定期搖晃罐體放氣。

1.2.6.2 指標的測定

總酯的測定：參考國標GB/T 10345—2007，采用指示劑法進行總酯測定，每個樣品做3組平行。

總酸的測定：參考國標GB/T 12456—2008，采用酸堿滴定法進行總酸測定，每個樣品做3組平行。

感官評價：本試驗初步探究酵母凍干菌劑對芫根發(fā)酵的影響，因此感官主要考察香氣指標，感官評價標準見表3。

表3 芫根感官評價指標

1.2.7 數據處理

采用Design Expert軟件進行試驗設計，SPSS軟件進行數據處理。

2 結果與分析討論

2.1 離心條件選擇

由圖1可知，隨著離心時間的延長，YC14存活率呈現先升高后降低的趨勢，其中3000 r/min及以上的轉速條件下，離心時間為5 min時，YC14存活率最高，而1500 r/min轉速條件下離心10 min達到最高存活率，可見離心條件對YC14存活率有明顯影響。在幾種不同的離心條件下，3000 r/min離心5 min時YC14存活率最高，為93.46%。

圖1 離心條件對酵母存活率的影響

2.2 保護劑單因素試驗

結合表1和表4可知，8種保護劑對YC14的冷凍干燥都有保護作用，但保護效果不同，其中，蔗糖添加量為13%時，凍干存活率最高，為46.93%；海藻糖添加量為11%時，凍干存活率最高，為71.04%；乳糖添加量為3%時，凍干存活率最高，為61.15%；脫脂乳粉添加量為6%時，凍干存活率最高，為85.74%；甘油添加量為5%時，凍干存活率最高，為55.92%；吐溫80添加量為5%時，凍干存活率最高，為86.47%；谷氨酸鈉添加量為4%時，凍干存活率最高，為78.59%；Vc添加量為1.2%時，凍干存活率最高，為46.32%。不論哪種保護劑，濃度過高或過低都會影響其保護效果。

表4 耐鹽生香酵母冷凍保護劑單因素試驗結果

2.3 單一保護劑選擇

利用SPSS軟件進一步對單因素試驗結果進行方差分析，判斷各保護劑對YC14凍干存活率的影響情況，以期選擇合適的保護劑，為后期保護劑復配試驗奠定基礎。

由表5可知，幾種保護劑對YC14凍干存活率的影響均具有顯著性，影響作用由大到小為乳糖>海藻糖>谷氨酸鈉>吐溫80>甘油、脫脂乳粉>Vc>蔗糖。從凍干存活率的角度分析，幾種保護劑對YC14凍干的保護效果由強至弱為吐溫80>脫脂乳粉>谷氨酸鈉>海藻糖>乳糖>甘油>蔗糖>Vc。單一保護劑不足以達到理想的效果，一般采用大分子保護劑與小分子保護劑結合、滲透性保護劑與非滲透性保護劑結合、糖類保護劑與蛋白質類保護劑結合的模式復配形成復合保護劑，以達到協同、增效的作用[24]。綜合考慮保護劑對YC14凍干存活率影響的顯著性、保護效果、成本、復配模式等方面因素，選擇乳糖、脫脂乳粉、吐溫80進行下階段復配試驗。

表5 各保護劑保護效果及顯著性分析

2.4 BBD響應面試驗結果

利用Design Expert 8.0.6.1 進行響應面試驗設計，試驗結果見表6。以乳糖(A)、脫脂乳粉(B)、吐溫80(C)為自變量，凍干存活率為響應值進行回歸擬合，得到回歸方程為：凍干存活率=-202.16725+92.25350A+12.41675B+42.49625C+1.95000AB+0.085000AC+1.92417BC-16.79475A2-2.09803B2-5.54725C2。

表6 響應面試驗設計及結果

續(xù) 表 %

由表7可知，整體模型達極顯著水平(P<0.0001)，表明該二次模型高度顯著，模型的失擬項不顯著(P>0.05)，說明該方程對試驗擬合較好，能真實解釋實際響應結果。模型C.V.為1.48%，遠小于10%，說明模型的穩(wěn)定性良好。決定系數R2為0.9981，說明該方程能較好地反應各因素與響應值之間的關系。信噪比為57.184>4，說明該模型有足夠的分辨能力，能反映試驗結果。

表7 響應面試驗回歸方程方差分析

由方差分析結果可知，A、B、AB、BC、A2、B2、C2對凍干保護效果的影響極顯著(P<0.0001)，C對凍干保護效果的影響顯著(P<0.05)，AC的交互作用影響不顯著(P>0.05)，各因素對凍干保護效果的響應面圖見圖2，與方差分析結果一致。由各因素對試驗指標的影響程度F值可知，各因素對凍干保護效果的影響程度為B>A>C，即脫脂乳粉>乳糖>吐溫80，該結論與單一保護劑選擇的結論“幾種保護劑對YC14凍干存活率均具有顯著性，影響作用大小為乳糖>海藻糖>谷氨酸鈉>吐溫80>甘油>脫脂乳粉>Vc>蔗糖”不同，可能是因為單一保護劑復配成混合體系后對菌株凍干存活率的顯著性影響會發(fā)生改變。

圖2 保護劑優(yōu)化響應面圖

由圖2響應面試驗分析可知，當乳糖、脫脂乳粉、吐溫80的添加量分別為3.15%、6.72%、5.02%時，酵母菌株凍干存活率為91.55%。經試驗驗證，實際凍干存活率為90.82%，見表8。相對誤差在1%以內，說明該模型可較準確地對凍干保護劑最優(yōu)配方進行預測。

表8 驗證試驗結果

2.5 真空冷凍干燥對耐鹽生香酵母產酯能力的影響

為了研究真空冷凍干燥是否影響耐鹽生香酵母的產酯能力，分別取新鮮酵母菌液和現制的酵母凍干菌劑(活酵母數量約為2.6×108個)接種至50 mL產酯培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r/min進行培養(yǎng)，并對其產酯能力進行檢測。由圖3可知，隨著時間的延長，新鮮菌液和凍干菌劑的產酯培養(yǎng)基中總酯含量逐漸增加，之后趨于穩(wěn)定，說明此時酯類物質的生成與揮發(fā)(可能還有酯酶的水解作用[25])進入平衡階段。在2～4 d的時間內，新鮮酵母產酯量高于凍干菌劑，主要原因可能是凍干菌劑在增殖前有一個活化的過程，增殖緩慢，酵母細胞數量較新鮮酵母培養(yǎng)液少，影響酯類物質的生成。第5天開始新鮮酵母菌液和凍干菌劑之間的產酯量差別不大，說明真空冷凍干燥并不影響生香酵母酯類物質的合成。

圖3 真空冷凍干燥對耐鹽生香酵母YC14產酯能力的影響

2.6 酵母凍干菌劑在芫根腌菜發(fā)酵中的應用

為評價凍干菌劑在芫根腌菜發(fā)酵過程中的效果，選擇室溫和28 ℃恒溫發(fā)酵30 d的芫根腌菜進行理化測定及感官評分，見表9。在不同溫度發(fā)酵條件下，接種活菌與凍干菌劑發(fā)酵后腌菜總酯、總酸含量以及感官評分均比未接種發(fā)酵顯著提高，說明產酯酵母YC14能夠顯著改善腌菜的品質；而接種活菌與凍干菌劑的腌菜在總酯、感官評分以及室溫發(fā)酵條件下總酸的差異并不明顯，進一步說明冷凍干燥對YC14菌株的影響較小。另外，較高的恒溫發(fā)酵條件更有利于酸與酯的形成，增加腌菜的感官評分，說明芫根腌菜的制備應選擇較高的發(fā)酵溫度，但更精確的芫根腌菜發(fā)酵適宜溫度有待進一步深入研究。

表9 不同發(fā)酵條件下芫根腌菜理化及感官分析結果

3 結論

試驗表明，在離心轉速為3000 r/min、離心時間為5 min時耐鹽生香酵母YC14離心存活率可達93.46%；以凍干存活率為指標，結合單因素及響應面試驗，當乳糖、脫脂乳粉、吐溫80的添加量分別為3.15%、6.72%、5.02%時，YC14預測凍干存活率最大，為91.55%，經試驗驗證，實際存活率為90.82%，誤差較小，為0.73%，說明該模型能夠較準確預測凍干保護劑的最優(yōu)配方，具有實際應用意義。冷凍干燥過程對YC14酯類物質的合成并沒有顯著的影響。將自制YC14凍干菌劑接種于芫根腌菜進行發(fā)酵，對發(fā)酵30 d的腌菜進行指標測定，接種YC14的芫根腌菜總酸、總酯以及感官品質都有一定程度的提高，在28 ℃的發(fā)酵環(huán)境下更利于芫根腌菜香氣的形成。