基于主成分及聚類分析的不同香精香料品質(zhì)綜合評價研究

邵佩，劉吟，明翠梅，劉興樂，謝超*

(1.武漢黃鶴樓香精香料有限公司，武漢 430040；2.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢 430040)

香精香料在日常生活及食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛[1]，主要作為改善、豐富食品香氣和香味的食品添加劑[2]，可被用于食品、酒類、卷煙、日化、醫(yī)藥等工業(yè)中[3]，具有較強(qiáng)的食用和藥用價值[4-5]。此外，部分香精香料因具有抗氧化和抑菌作用，也被作為化妝品的重要原料[6]。香精香料也是卷煙生產(chǎn)過程中必不可少的原料，添加后可以改善卷煙的口感和味道，提高卷煙的品質(zhì)[7]。目前，主要通過物理指標(biāo)和化學(xué)成分來控制香精香料的質(zhì)量，隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展，國內(nèi)對香精香料化學(xué)成分分析方面進(jìn)行了大量報道，主要包括氣相色譜法[8]、高效液相色譜法[9-10]、氣相/液相色譜-質(zhì)譜法[11-12]等。

糖類是香精香料中的重要成分，有研究表明增加可溶性糖類含量能夠有效改善風(fēng)味，并且在高溫燃燒時，還原糖能夠分解成具有香味的簡單酮類和醛類物質(zhì)[13]。目前對糖類的分析方法主要有高效液相色譜法[14]、氣相色譜法[15]、紙層析法[16]等，而高效液相色譜法因具有分析效率高、速度快和操作自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[17]。目前國內(nèi)外常用于糖類的檢測器有紫外檢測器(UV)[18]、二極管陣列檢測器(DAD)、示差折光檢測器(RID)[19]、熒光檢測器(FLD)[20]和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)[21]等，但UV、DAD和FLD需要柱前衍生，操作復(fù)雜；RID和ELSD雖不需要柱前衍生，但RID靈敏度低，組分分析效果不好[22]，ELSD穩(wěn)定性較差；CAD檢測器作為一種新興的通用型檢測器，可用于檢測所有非揮發(fā)性和部分半揮發(fā)性化合物，檢測范圍寬，在化合物無紫外吸收或較弱紫外吸收時體現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢，能夠彌補(bǔ)其他檢測器的不足，操作簡單，靈敏度和重現(xiàn)性更高。目前關(guān)于香精香料的相關(guān)研究主要集中在香氣成分分析，用HPLC-CAD法分析香精香料中糖類化合物、香精香料品質(zhì)控制與評價的相關(guān)報道較少。

香精香料的品種繁多，其化學(xué)成分和物理指標(biāo)也有所不同。為了研究不同香精香料的品質(zhì)差異，本研究建立了一種HPLC-CAD法用于測定香精香料中果糖、葡萄糖和蔗糖含量，并對18種香精香料包括糖類在內(nèi)的6個指標(biāo)進(jìn)行測定，通過主成分分析、聚類分析和綜合評價進(jìn)行品質(zhì)評價，以期為香精香料品質(zhì)的全面質(zhì)量控制和綜合評價利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

對照品D-果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖(純度>99%)：由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈：色譜純，美國Fisher公司；水：超純水；18種香精香料樣品：武漢黃鶴樓香精香料有限公司抽樣，其中S1～S6對應(yīng)類別為XJ1；S7～S12對應(yīng)類別為XJ2；S13～S18對應(yīng)類別為XJ3。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UltiMate 3000高效液相色譜儀(包括Corona Veo電噴霧檢測器、Chromeleon 7.2色譜工作站) 美國ThermoFisher Scientific公司；AL204電子分析天平、T50全自動電位滴定儀 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ-600DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Corona 1010氮?dú)獍l(fā)生器 畢克氣體儀器貿(mào)易(上海)有限公司；Smart-S15超純水儀 上海和泰儀器有限公司；DMA4500-RXA170全自動密度折光儀 奧地利安東帕(中國)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖對照品適量(精確到0.0001 g)，分別置于100 mL容量瓶中，加入超純水5 mL溶解，再加入乙腈并定容，搖勻，制得果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖對照品儲備溶液的濃度分別為5.074，5.069，5.039 mg/mL，備用。

1.3.2 供試品溶液的制備

精密稱量樣品約0.1 g，置于50 mL離心管中，加入25 mL水，渦旋振蕩10 min，離心5 min(轉(zhuǎn)速8000 r/min)后取上層清液過0.22 μm水相濾膜，即得供試品溶液。

1.3.3 色譜條件

采用色譜柱：Agilent ZORBAX Carbohydrate(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相：乙腈-水(80∶20)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。CAD檢測器：采集頻率10 Hz；濾光片10 s；溫度35 ℃；氣源：氮?dú)狻?/p>

1.3.4 樣品理化指標(biāo)的測定

酸值參照GB 5009.229-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價的測定》，相對密度參照GB 5009.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品相對密度的測定》，折光指數(shù)參照GB/T 14454.4-2008《香料 折光指數(shù)的測定》。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)樣品均測定3次，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用SPSS 23.0軟件進(jìn)行差異性分析(P<0.05)、相關(guān)性分析、主成分分析(PCA)和聚類分析，并采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 流動相選擇

在色譜條件的方法學(xué)研究中，考察了不同比例的流動相、流速和柱溫等條件。通過分別采用乙腈-水為83∶17、80∶20、78∶22、75∶25、70∶30、65∶35這6種流動相比例進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，增加有機(jī)相會使峰形變寬，分析時間延長，而提高水相有利于糖類的溶解，縮短分析時間，但不利于各組分的分離；綜合考慮發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙腈-水的比例為80∶20時，分離度合適，峰寬較小，峰高較高，在15 min內(nèi)可達(dá)到良好的分離效果，因此流動相選擇乙腈-水為80∶20(體積比)。

2.1.2 流速及柱溫選擇

同時，考察了0.8，1.0，1.2 mL/min 3種流速及不同柱溫(25，30，35 ℃)對色譜峰分離效果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)流速為0.8 mL/min時，分析時間延長，峰寬較大；而當(dāng)流速增大時，分析時間縮短，峰寬變小，綜合考慮，選擇流速為1.0 mL/min，此時保留時間適宜，分離度好，峰寬較小；而柱溫對保留時間、峰寬、峰高及分離度則無明顯影響，最終選擇與試驗(yàn)環(huán)境接近的30 ℃作為柱溫。

2.1.3 CAD檢測器參數(shù)選擇

在CAD檢測器的方法學(xué)研究中，對檢測器的采集頻率和濾光片常數(shù)進(jìn)行了考察。通過選擇采集頻率(5，10，20 Hz)進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示，采集頻率對色譜峰的平滑度無影響，因此選用采集頻率10 Hz。同時考察濾光片常數(shù)1.0，2.0，3.6，5，10 s對色譜峰的影響，結(jié)果顯示，其數(shù)值越大，峰越平滑，因此選用濾光片常數(shù)為10 s。

2.1.4 專屬性試驗(yàn)

取對照品溶液(果糖、葡萄糖和蔗糖溶液)以及空白溶液各10 μL，按1.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，果糖、葡萄糖和蔗糖的分離度好，均大于1.5，空白溶劑測定時無干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

取混合對照品儲備液，逐步定量稀釋成不同的濃度梯度。按1.3.3項(xiàng)下色譜條件測量，記錄峰面積，以對照品濃度(X，mg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程，具體結(jié)果見表1。

取最小濃度梯度的對照品溶液稀釋到合適倍數(shù)后進(jìn)樣，按1.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以信噪比(S/N)為10∶1、3∶1計(jì)算檢測限和定量限，具體結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取一定質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按1.3.3項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄3種糖的峰面積，測得果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面積RSD分別為1.87%、2.01%、1.34%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取1.3.2項(xiàng)下制備的供試品溶液6份，按1.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄3種糖的峰面積，測得果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面積RSD分別為1.92%、1.53%、2.06%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1.3.2項(xiàng)下供試品溶液，分別放置0，2，4，8，16，24 h后，按1.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄3種糖的峰面積，測得果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面積RSD分別為2.79%、3.15%、4.01%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn)

稱取適量樣品3份，依次加入適量對照品，用水稀釋至刻度，搖勻，按1.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。3種糖的平均回收率在96.2%～99.2%之間。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.4 樣品單糖含量的測定

取18種香精香料樣品，按1.3.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按1.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中3種糖的含量，結(jié)果見表3。

表3 HPLC-CAD方法測定香精香料中3種糖類的含量

續(xù) 表

由表3和圖2可知，不同種類香精香料中果糖、葡萄糖含量存在顯著性差異(P<0.05)，果糖含量為0.96%～3.25%，其中S9含量最高，S14含量最低；葡萄糖含量為3.92%～11.27%，其中S10含量最高，S16含量最低；蔗糖含量為0.81%～1.47%，其中S18含量最高，S6含量最低。18種香精香料中糖類成分的含量從高到低為D-無水葡萄糖>果糖>蔗糖，其中D-無水葡萄糖含量從高到低依次為XJ2>XJ1>XJ3，果糖含量從高到低依次為XJ2>XJ1>XJ3，而不同種類蔗糖含量XJ3中最多。

圖2 樣品高效液相色譜圖

2.5 樣品理化指標(biāo)的測定

相對密度、折光指數(shù)和酸值影響著香精香料的品質(zhì)和風(fēng)味。由表4可知，不同種類香精香料中理化指標(biāo)存在顯著性差異(P<0.05)，相對密度在0.9815～1.1431 g/cm3，其中S10含量最高，S17含量最低；折光指數(shù)在1.3779～1.3994，其中S10含量最高，S5含量最低；酸值在7.47～22.56 mg/g，其中S11含量最高，S15含量最低。總體而言，理化指標(biāo)最高的香精香料為XJ2。

表4 不同香精香料理化性質(zhì)對比

2.6 不同香精香料綜合品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析

對18種香精香料的綜合品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析后，由表5可知，6種品質(zhì)指標(biāo)之間存在不同程度的相關(guān)性，其中折光指數(shù)和蔗糖含量、酸值和折光指數(shù)之間沒有相關(guān)性，果糖與葡萄糖含量、相對密度、折光指數(shù)和酸值呈極顯著正相關(guān)，與蔗糖呈極顯著負(fù)相關(guān)；葡萄糖與相對密度、折光指數(shù)和酸值呈極顯著正相關(guān)，與蔗糖呈極顯著負(fù)相關(guān)；蔗糖與相對密度和酸值呈極顯著負(fù)相關(guān)；相對密度和酸值呈顯著正相關(guān)，折光指數(shù)與酸值不存在顯著相關(guān)性。因此，由于18種香精香料含量差異不同，各品質(zhì)指標(biāo)之間均存在不同程度的相關(guān)性，僅用某一個指標(biāo)來評價不同香精香料的品質(zhì)是不合理的。

表5 不同香精香料品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

續(xù) 表

2.7 不同香精香料綜合品質(zhì)指標(biāo)的主成分分析

2.7.1 主成分提取

以18種香精香料中糖類水解產(chǎn)物的葡萄糖、果糖、蔗糖及折光指數(shù)、相對密度和酸值為提取特征，導(dǎo)入SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行主成分分析，對18種香精香料的6種指標(biāo)結(jié)果進(jìn)行KMO和Bartlett檢驗(yàn)，結(jié)果表明顯著性值P<0.01，說明此研究可以采用主成分分析法[23]。香精香料主成分的特征值、累計(jì)貢獻(xiàn)率和成分載荷矩陣分析結(jié)果見表6、表7和圖3。以特征值大于1的前兩個主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為97.297%，綜合了18種香精香料的6個品質(zhì)指標(biāo)的大部分信息，主成分1主要反映果糖、葡萄糖、相對密度和酸值，主成分2主要反映折光指數(shù)，可以用這兩個主成分代替上述的6個品質(zhì)指標(biāo)對18種不同的香精香料進(jìn)行品質(zhì)綜合評價[24-25]。PCA結(jié)果圖顯示[26]，18種樣品大致分為3類，其中S1～S6為一類，S7～S12為一類，其他樣品為一類。

表6 特征值及累計(jì)方差貢獻(xiàn)率

表7 主成分載荷矩陣

圖3 18種香精香料主成分得分圖

2.7.2 綜合評價

設(shè)提取的主成分1和主成分2得分分別為Y1、Y2，根據(jù)表6建立各成分得分模型：

Y1=0.449ZX1+0.444ZX2-0.370ZX3+0.459ZX4+0.246ZX5+0.439ZX6。

Y2=0.150ZX1+0.200ZX2+0.516ZX3-0.067ZX4+0.766ZX5-0.281ZX6。

再根據(jù)表6中提取的兩個主成分所對應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率和累計(jì)貢獻(xiàn)率，以它們的比值為權(quán)重建立綜合得分模型：

Y綜合=0.806Y1+0.194Y2。

將Y1、Y2得分代入綜合得分模型中，計(jì)算出不同香精香料綜合品質(zhì)的綜合評分，并進(jìn)行排名。得分越高，證明其品質(zhì)越好，結(jié)果見表8。

表8 不同香精香料品質(zhì)綜合得分排名

續(xù) 表

由表8可知，以18個不同香精香料品種綜合品質(zhì)指標(biāo)來說，按照綜合得分排名為：S10>S9>S12>S8>S7>S11>S6>S2>S4>S3>S1>S5>S16>S18>S13>S17>S15>S14。其中XJ2類別中的6種產(chǎn)品得分較高，說明本研究中這類產(chǎn)品的綜合品質(zhì)較好。XJ1和XJ3的得分較低，說明其綜合品質(zhì)較差。

2.8 不同香精香料綜合品質(zhì)指標(biāo)的聚類分析

香精香料品質(zhì)指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)較為離散，不易對香精香料各類品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行直觀評價[27-28]。因此，將指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用組間聯(lián)接法對18種香精香料綜合品質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖4。

圖4 18種香精香料品質(zhì)綜合評價聚類樹狀圖

由圖4可知，在歐氏距離為7.5時，18種產(chǎn)品可以聚為三類，S1～S6聚為一類，S7～S12聚為一類，S13～S18聚為一類[29-30]。主成分和聚類分析結(jié)果與樣品的實(shí)際情況基本一致，所選成分可以完全反映不同香精香料之間的差異。

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC-CAD法同時測定香精香料中糖類的檢測方法，能在20 min內(nèi)完成果糖、葡萄糖和蔗糖的分離。該方法檢出限低，回收率、精密度和穩(wěn)定性均能滿足實(shí)際分析的需求，與DAD、ESLD檢測法等相比，該方法具有靈敏度高、操作簡單、不需要衍生化處理等優(yōu)點(diǎn)，能為香精香料的全面質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。此外，本研究選取了有代表性的3個理化品質(zhì)指標(biāo)，使用相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析對不同香精香料的品質(zhì)進(jìn)行綜合評分和排名。通過測定各指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，不同香精香料綜合品質(zhì)指標(biāo)之間存在顯著性差異，各有優(yōu)劣，很難判別總體品質(zhì)水平。對不同種類香精香料綜合品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大部分指標(biāo)之間存在顯著相關(guān)性；再運(yùn)用主成分分析，提取出兩個主成分(特征值>1)，計(jì)算各成分得分，通過建立綜合得分模型排序和聚類分析得到，XJ1類別香精香料的綜合品質(zhì)較好，XJ3類別綜合品質(zhì)較差，其他樣品綜合品質(zhì)居中。進(jìn)一步對兩大主成分因子分別進(jìn)行品種的聚類分析，可按照不同需求選擇樣品。因此，本研究可以為之后不同香精香料品種的分析提供理論依據(jù)，為香精香料質(zhì)量控制和綜合評價奠定基礎(chǔ)。