雙清平化方對代謝綜合征大鼠骨骼肌自噬通路蛋白表達的影響

付文浩，田春雨，喇孝瑾，張國偉，張 敏，王瑤瑤，陳瑞軍，王秀萍，李繼安*

雙清平化方對代謝綜合征大鼠骨骼肌自噬通路蛋白表達的影響

付文浩1, 2，田春雨1，喇孝瑾1，張國偉1，張 敏1，王瑤瑤1，陳瑞軍1，王秀萍3，李繼安1*

1. 華北理工大學中醫學院 河北省中西醫結合防治糖尿病及其并發癥重點實驗室，河北 唐山 063210 2. 涉縣中醫院，河北 邯鄲 056400 3. 河北省農林科學院濱海農業研究所，河北 唐山 063210

觀察雙清平化方對代謝綜合征大鼠Lee’s指數、血糖、血脂及骨骼肌哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、自噬效應蛋白1（Beclin1）、微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3）蛋白表達的影響，探討其改善糖脂代謝的作用機制。大鼠給予高脂飼料加10%果糖水溶液喂養，并聯合應用-硝基--精氨酸甲酯（-nitro--arginine methyl ester，-NAME）及鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導代謝綜合征模型。代謝綜合征大鼠給予雙清平化方或二甲雙胍干預8周，實驗前后定期測量大鼠體質量、體長、腹圍、血壓、糖耐量、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，GHb）、胰島素（insulin，INS）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C），計算葡萄糖曲線下面積（OGTT-AUC）和胰島素抵抗指數（HOMA-IR）；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察骨骼肌組織病理形態學變化；采用Masson染色觀察骨骼肌纖維形態變化；采用免疫組化法檢測骨骼肌組織中LC3蛋白表達；采用Western blotting檢測骨骼肌組織中mTOR、Beclin1和LC3蛋白表達。與對照組比較，模型組大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、餐后2 h血糖（2 h postprandial glucose，PG2h）、OGTT-AUC、HOMA-IR、INS、GHb、TC、TG及LDL-C水平均顯著升高（＜0.01），HDL-C水平顯著降低（＜0.01）；骨骼肌組織中mTOR蛋白表達顯著上調（＜0.01），Beclin1、LC3蛋白表達顯著下調（＜0.01）。與模型組比較，雙清平化方組FBG、PG2h、OGTT-AUC、HOMA-IR、INS、GHb、TC、TG及LDL-C水平均顯著降低（＜0.05、0.01），HDL-C水平顯著升高（＜0.01）；骨骼肌組織中mTOR蛋白表達水平顯著上調（＜0.01），Beclin1和LC3蛋白表達顯著下調（＜0.01）。雙清平化方可以改善代謝綜合征大鼠胰島素抵抗，改善糖脂代謝水平，抑制骨骼肌病理變化，其作用機制可能與調節骨骼肌自噬，激活骨骼肌組織自噬通路中mTOR、Beclin1、LC3蛋白表達有關。

雙清平化方；代謝綜合征；骨骼肌；自噬；胰島素抵抗

代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）是肥胖并伴有高血壓及糖、脂代謝異常癥候群，是心腦血管病的主要危險因素[1-3]。目前，我國老年人群中MS患病率已達25.5%，預計到2035年成人MS患病率可達35%～50%[4-5]。因此，預防和治療MS已成為醫學研究的熱點。胰島素抵抗是MS發病的重要病理基礎，而骨骼肌是胰島素抵抗的重要靶組織。研究顯示自噬與胰島素抵抗密切相關，并參與了胰島素抵抗的發生與進展。

現代醫學的治療方案尚停留在對癥治療以及延緩疾病進展的階段，糾正代謝紊亂是治療MS的研究方向。根據臨床MS病證分析，肝胃火旺、痰濁不化為其常見病證，本課題組依據臨床經驗和藥理實驗總結出防治該證的雙清平化方[6]。推測是否通過調節骨骼肌自噬，進而改善骨骼肌能量的穩態及胰島素抵抗。為此，本實驗構建MS大鼠模型，以不同劑量雙清平化方進行干預，觀察其對模型大鼠Lee’s指數、血壓、血糖、血脂、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，GHb）、胰島素（insulin，INS）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）的影響及骨骼肌組織病理形態學、骨骼肌組織中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、自噬效應蛋白1（Beclin1）、微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3）蛋白表達的變化，探討雙清平化方改善MS大鼠糖脂代謝的作用機制，為其治療MS提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物

1.2 藥材

雙清平化方組成為桑葉、蒲公英、生山楂、決明子、萊菔子、夏枯草、葛根、海藻粉、炒蕎麥粉、珍珠粉。蒲公英購自河北省農林科學院濱海農業研究所，其余藥材均購自于唐山市北京同仁堂藥店，經華北理工大學田春雨教授鑒定桑葉為桑科植物桑L.的干燥葉，蒲公英為菊科植物堿地蒲公英Kitam.的干燥全草，生山楂為薔薇科植物山楂Bge.的干燥成熟果實，決明子為豆科植物決明L.的干燥成熟種子，萊菔子為十字花科植物蘿卜L.的干燥成熟種子，夏枯草為唇形科植物夏枯草L.的干燥果穗，葛根為豆科植物野葛(Wild.) Ohwi的干燥根，海藻為馬尾藻科植物海蒿子(Tum.) C. Ag.的干燥藻體，炒蕎麥為蓼科植物蕎麥Moench.的干燥成熟種子，珍珠粉為珍珠貝科動物馬氏珍珠貝(Dunker)受刺激形成的珍珠粉末。

1.3 藥品與試劑

普通飼料[豫飼證（2008）25540]購自北京環宇中科生物科技有限公司；高脂飼料（批號SN10141）購自賽諾生物科技有限公司；對照品綠原酸（批號110753-202018）、咖啡酸（批號110885-201703）、菊苣酸（批號111752-202104）、葛根素（批號110752-201816）均購自中國食品藥品檢定研究院，質量分數均為98%；鹽酸二甲雙胍片（批號190401）購自中美上海施貴寶制藥有限公司；組織固定液（批號MA0192）購自大連美侖生物科技有限公司；GHb試劑盒（批號20191008）、INS試劑盒（批號H203-1-2）、TC試劑盒（批號：20190930）、TG試劑盒（批號20190929）、LDL-C試劑盒（批號20190929）、HDL-C試劑盒（批號20190930）均購自南京建成生物工程研究所；-硝基--精氨酸甲酯（-nitro--arginine methyl ester，-NAME，批號A7088-25）購自APE BIO Technology LLC公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批號BJBAG2001）購自北京博愛港生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號A91041）購自杭州聯科生物技術股份有限公司；快速十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒（批號ZD304）購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；β-actin抗體（批號9100026001）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；mTOR抗體（批號20657-1-AP）、Beclin1抗體（批號11306-1-AP）、LC3抗體（批號14600-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號10226187）購自美國Seracare公司。

1.4 儀器

1OH55IH1538型穩益血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；TP1020型組織脫水機、RM2245型組織切片機（德國Leica公司）；電泳儀、成像系統ChemiDocTM CXRS＋System（美國Bio-Rad公司）；M200PR0型酶標儀（瑞士Tecan公司）；正置顯微鏡（日本Olympus公司）；LC-20A型液相色譜儀（日本島津公司）。

2 方法

2.1 雙清平化方的制備

取桑葉10 g、蒲公英30 g、生山楂20 g、決明子10 g、萊菔子10 g、夏枯草20 g、葛根20 g、海藻粉3 g、炒蕎麥粉30 g、珍珠粉1 g，打成粗末，加6倍量的水浸泡1 h后，煎煮1.5 h，濾過，藥渣再加入4倍量的水煎煮1.5 h，濾過，混合2次水煎液，低溫高速離心2 h，取上清液，于100 ℃的水浴鍋中濃縮。經高效液相色譜檢測，主要含葛根素0.30%、綠原酸0.034%、咖啡酸0.0096%和菊苣酸0.065%。

2.2 造模、分組及給藥

60只雄性SD大鼠給予普通飼料適應性飼養1周后，隨機分為對照組（10只）和造模組（50只），對照組給予普通飼料及純水，造模組給予高脂飼料及10%果糖水溶液喂養，飼養至第11周實驗組大鼠ig-NAME（20 mg/kg）2周，并于第13周ip STZ（30 mg/kg），對照組ig等體積生理鹽水并ip枸櫞酸鈉緩沖液。實驗第8、12、14周測量各組大鼠體長、體質量、腹圍，并根據公式計算Lee’s指數[7]；實驗第0、4、8、12、14周測量各組大鼠血壓。第14周評估成模情況[7-8]，評價指標為①中心性肥胖：Lee’s指數或體質量及腰圍顯著變化；②高血壓：收縮壓或舒張壓顯著變化；③高血糖：11.1 mmol/L＜空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）＜16.7 mmol/L或餐后2 h血糖（2 h postprandial glucose，PG2h）＞16.7 mmol/L。

將成模大鼠按血糖隨機分為模型組、二甲雙胍（0.18 g/kg）組和雙清平化方低、中、高劑量（3.47、6.93、13.38 g/kg，分別相當于臨床劑量的0.5、1、2倍）組，每組各10只[9]。各給藥組ig相應藥物，1次/d，連續8周。

2.3 血清學檢測

藥物干預前及干預第4、8周末尾靜脈采血，檢測大鼠FBG及PG2h；計算葡萄糖曲線下面積（OGTT-AUC）和胰島素抵抗指數（HOMA-IR）。于藥物干預第8周末，ip 10%水合氯醛-氨基甲酸乙酯（1 mL/kg）[10]，腹主動脈采血，離心后取血清，根據試劑盒說明書進行相應指標的檢測。

2.4 骨骼肌組織病理變化觀察

采血后立即取大鼠雙側后肢腓腸肌，于4%多聚甲醛中固定，固定完成后進行脫水、包埋、切片以及脫蠟，按蘇木素-伊紅（HE）染液試劑盒說明書進行HE常規染色，觀察骨骼肌組織形態學變化；按Masson染液試劑盒說明書進行Masson染色，觀察骨骼肌組織纖維變化。

比較3個響應電流可得,i1>i3>i2。根據表1,可知(Lc+Lb)>(La+Lc)>(Lb+La),此時轉子位于180°～240°電角度區間。再根據定位力矩與轉子位置的關系,以及i1與i3大小幾乎相等可知,轉子位于180°電角度位置。

2.5 免疫組化檢測骨骼肌組織中LC3蛋白表達

取“2.4”項下脫蠟后的切片進行抗原修復，內源性過氧化氫酶阻斷，滴加山羊血清封閉，滴加LC3抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜，滴加生物素標記山羊抗兔IgG聚合物，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，流水沖洗，蘇木素染色，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化液分化，梯度脫水，二甲苯透明，封片，于顯微鏡下觀察。

2.6 Western blotting檢測骨骼肌組織中mTOR、Beclin1和LC3蛋白表達

各組大鼠骨骼肌組織剪碎后，放入含蛋白酶抑制劑的裂解液，勻漿提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品經10% SDS-PAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉2 h，分別加入mTOR（1∶1000）、p-mTOR（1∶1000）、Beclin1（1∶2000）、LC3（1∶1000）抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入山羊抗兔二抗（1∶5000），搖床孵育2 h，TBST洗滌，進行凝膠成像分析。

2.7 統計學方法

結果采用Graphpad prism 8.0軟件進行分析，采用單因素方差分析進行多組間比較，先進行方差齊性檢驗，方差齊進行兩兩比較，若方差不齊則采用Brown-Forsythe和Welch方差分析。

3 結果

3.1 MS大鼠成模體長、體質量、腹圍、Lee’s指數和血壓測定

如圖1所示，大鼠飼養4周后體長、體質量、腹圍及Lee’s指數均呈現出增長趨勢，飼養8周后模型組大鼠體質量、腹圍、Lee’s指數與對照組相比均具有統計學差異（＜0.05），飼養12、14周后模型組大鼠體長與對照組相比具有統計學差異（＜0.05），模型組大鼠在造模階段收縮壓和舒張壓從12周開始至14周明顯升高（＜0.01）。

3.2 雙清平化方對MS大鼠FBG和PG2h的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠FBG和PG2h均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，給藥4周后，二甲雙胍組和雙清平化方高劑量組大鼠FBG顯著降低（＜0.01），二甲雙胍組和雙清平化方中、高劑量組PG2h顯著降低（＜0.05、0.01）；給藥8周后，二甲雙胍組和雙清平化方中、高劑量組FBG和PG2h均明顯降低（＜0.05、0.01）。

3.3 雙清平化方對MS大鼠OGTT-AUC、INS、HOMA-IR及GHb的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠OGTT-AUC、INS、HOMA-IR和GHb均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，給藥4周后，二甲雙胍組和雙清平化方中、高劑量組OGTT-AUC明顯下降（＜0.05、0.01）；給藥8周后，二甲雙胍組和雙清平化方中、高劑量組OGTT-AUC和HOMA-IR明顯下降（＜0.05、0.01），二甲雙胍組和雙清平化方高劑量組INS和GHb均明顯下降（＜0.01）。

A-對照組 B-模型組 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，1 mm Hg＝133 Pa

A-對照組 B-模型組 C-二甲雙胍組 D-雙清平化方低劑量組 E-雙清平化方中劑量組 F-雙清平化方高劑量組 與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

圖3 雙清平化方對MS大鼠OGTT-AUC、INS、HOMA-IR及GHb的影響(, n = 10)

3.4 雙清平化方對MS大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中HDL-C水平顯著降低（＜0.01），TC、TG和LDL-C水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中HDL-C水平顯著升高（＜0.01），TC、TG和LDL-C水平均顯著降低（＜0.01）。

3.5 雙清平化方對MS大鼠骨骼肌組織病理變化的影響

如圖5所示，腓腸肌HE染色后，光鏡下可見細胞核為藍色，細胞質、肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈深淺不一的紅色。對照組大鼠骨骼肌肌纖維排列整齊、胞質均勻，細胞核排列正常、形態規則；模型組大鼠骨骼肌纖維排列疏松紊亂，胞質不勻，細胞核增多并出現核內移，見少量炎細胞浸潤；與模型組比較，雙清平化方低、中劑量組肌纖維排列有所好轉，細胞核增多，核內移減少，炎細胞浸潤明顯改善；二甲雙胍組和雙清平化方高劑量組纖維排列相對整齊，胞質較為均勻，細胞核形態有所好轉，細胞核及核內移減少，未見炎細胞浸潤。

圖4 雙清平化方對MS大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影響 (, n = 10)

圖5 雙清平化方對MS大鼠骨骼肌組織病理變化的影響(×40)

Masson染色結果顯示，對照組大鼠腓腸肌結構完整，肌纖維排列整齊且形態規則，未見明顯萎縮，肌纖維間膠原纖維較少；模型組出現增生的結締組織，膠原纖維逐漸增多且肌纖維間距因膠原纖維的增生而變寬；與模型組比較，雙清平化方低劑量組膠原纖維減少；雙清平化方中劑量組肌纖維間距縮短，結締組織和膠原纖維減少；二甲雙胍組和雙清平化方高劑量組肌纖維形態較規則，纖維間距縮短，膠原纖維減少，未見增生的結締組織。

3.6 免疫組化法檢測MS大鼠骨骼肌組織中LC3蛋白表達

如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌組織中LC3蛋白陽性表達顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠骨骼肌組織中LC3蛋白陽性表達均顯著升高（＜0.01）。

3.7 Western blotting檢測MS大鼠骨骼肌組織中mTOR、Beclin1和LC3蛋白表達

如圖7所示，與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌組織中p-mTOR蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），Beclin1和LC3蛋白表達水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，雙清平化方高劑量組大鼠骨骼肌組織中p-mTOR蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），Beclin1和LC3蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01）。

圖6 雙清平化方對MS大鼠骨骼肌組織中LC3蛋白表達的影響

圖7 雙清平化方對MS大鼠骨骼肌組織中p-mTOR、Beclin1和LC3蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

自噬異常可通過內質網應激、氧化應激、促炎癥信號途徑等導致胰島素抵抗的發生[11]。骨骼肌是機體葡萄糖、脂質攝取和利用的主要部位，約70%的葡萄糖通過胰島素依賴的方式被骨骼肌攝取利用，同時骨骼肌也是發生胰島素抵抗的重要靶組織[12]。研究發現，2型糖尿病患者骨骼肌內細胞器發生重構、外膜細胞退化及凋亡、肌膜下線粒體減少、肌細胞內脂質沉積等，在臨床上表現為胰島素抵抗，而自噬異常可能是主要原因之一[13]。因此，探索MS骨骼肌胰島素抵抗與自噬關系并指導藥物治療研究具有重要學術價值。改善胰島素抵抗是治療和預防MS的重要策略，從調節自噬途徑研究中藥改善胰島素抵抗也是一個新的研究方向。骨骼肌自噬對血糖、血脂比較敏感，高糖、高脂可激活mTOR誘導的自噬活性降低，表現為自噬體形成的標志物LC3II的表達減少[14]；Bloemberg等[15]研究發現，骨骼肌細胞mTOR活性升高可抑制細胞自噬信號通路，參與了MS的發病。mTOR、Beclin1和LC3是自噬通路中主要標志物，可用于評價組織細胞自噬水平[16]。mTOR是負性調節自噬的重要信號，mTOR被抑制時可誘導自噬的發生[17]；Beclin1又名Atg6，作為自噬通路上的一個平臺蛋白，通過與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）形成新復合物來調節其他ATG蛋白在自噬前體結構中定位，進而促進自噬體膜的形成并調節自噬活性[18]；LC3是定位在雙層膜和自噬體的特異性信號蛋白，可剪切為LC3Ⅰ和LC3II 2種同源物，其中LC3II作為脂質化表達于自噬體膜上，其含量和自噬泡的數量可以反映組織的自噬水平[19-20]。為此，通過觀察藥物對mTOR、Beclin1和LC3等主要標志物表達的影響及對HOMA-IR、糖脂代謝指標的變化，可進一步判斷自噬與胰島素抵抗的關系及藥物對自噬的調節作用。

中醫沒有MS病名，就其臨床特征與中醫脾癉相類，根據《黃帝內經》“肥者令人內熱，甘者令人中滿”的發病機制，結合臨床證候分析發現MS患者嗜食肥甘厚味、精神壓力大，形體肥胖且肝陽亢盛者居多，病機特點為肝胃火旺、氣機失暢、痰濁不化[12]。針對病機結合本課題組多年從肝胃郁熱治療MS經驗，選擇了藥食同源的中藥組成雙清平化方。方中夏枯草、蒲公英清肝胃郁熱為君藥，桑葉、珍珠粉、決明子、生山楂、萊菔子、海藻粉、炒蕎麥粉助主藥平肝清胃化濁為臣藥，葛根升陽、生津為佐使藥，全方清肝胃郁熱、理氣化濁、升降有序。中藥藥理研究發現，蒲公英、桑葉、葛根可有效改善胰島素抵抗[21-22]；夏枯草、草決明、山楂、萊菔子等可有效調節血脂、降血壓等，通過理論分析全方配伍具有MS中醫病機針對性及調節糖脂代謝、改善胰島素抵抗的藥理針對性，并且配方均由藥食同源中藥組成，臨床應用具有良好的順應性。為此，本研究通過考察雙清平化方對MS大鼠糖脂代謝及對骨骼肌自噬信號蛋白表達的影響，評價其藥理效應并初步探究其對骨骼肌自噬及胰島素抵抗的作用機制。

本研究參照文獻方法[7-8]制備MS模型，結果顯示模型組大鼠體長、體質量、腹圍、Lee’s指數、FBG、PG2h、OGTT-AUC、GHb、HOMA-IR及血脂水平與對照組相比均明顯升高，表明MS大鼠建模成功。雙清平化方干預后可降低大鼠FBG、PG2h、OGTT-AUC、GHb、HOMA-IR及血脂水平，表明雙清平化方對MS具有調節作用并改善胰島素抵抗。通過免疫組化和Western blotting實驗發現，模型組大鼠骨骼肌組織中mTOR蛋白表達上調，Beclin1和LC3蛋白表達下調，骨骼肌出現纖維排列疏松紊亂，胞質不勻，細胞核增多、核內移及少量炎細胞浸潤現象，由此表明，高脂高糖誘導的MS模型大鼠骨骼肌存在自噬抑制及炎癥激活現象。雙清平化方組大鼠骨骼肌組織中mTOR蛋白表達下調，Beclin1和LC3蛋白表達上調，骨骼肌病理具有一定的改善，說明雙清平化方可調節MS大鼠骨骼肌自噬信號蛋白的表達，促進高脂高糖環境下骨骼肌自噬，對于保護骨骼肌的自身穩態是有益的。

綜上所述，雙清平化方能夠有效改善MS大鼠糖、脂代謝、胰島素抵抗及骨骼肌的自身穩態，其作用機制可能與下調mTOR、上調Beclin1和LC3的蛋白表達，調節骨骼肌自噬水平有關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Razavi A C, Wong N, Budoff M,. Predicting long-term absence of coronary artery calcium in metabolic syndrome and diabetes: The MESA study [J]., 2021, 14(1): 219-229.

[2] Alyavi A, Alyavi B, Uzokov J. Prognostic value of metabolic syndrome for the development of type 2 diabetes mellitus and cardiovascular disease [J]., 2020, 315: e180.

[3] Koyama T, Maekawa M, Ozaki E,. Daily consumption of coffee and eating bread at breakfast time is associated with lower visceral adipose tissue and with lower prevalence of both visceral obesity and metabolic syndrome in Japanese populations: A cross-sectional study [J]., 2020, 12(10): 3090.

[4] 中華醫學會糖尿病學分會. 中國2型糖尿病防治指南(2017年版) [J]. 中國實用內科雜志, 2018, 38(4): 292-344.

[5] Lu J L, Wang L M, Li M,. Metabolic syndrome among adults in China: The 2010 China noncommunicable disease surveillance [J]., 2017, 102(2): 507-515.

[6] 王瑤瑤, 喇孝瑾, 張大偉, 等. 雙清平化方對代謝綜合征大鼠血壓、胰島素抵抗、RAS系統及血管內皮功能的影響 [J]. 現代中西醫結合雜志, 2021, 30(20): 2172-2178.

[7] 夏燕萍, 陳剛, 俞茂華. 高糖高脂飲食誘導建立SD大鼠代謝綜合征模型 [J]. 中國現代醫學雜志, 2009, 19(17): 2607-2609.

[8] 李耀華, 謝萍, 王娟. 代謝綜合征大鼠模型的建立及評價 [J]. 醫學研究雜志, 2017, 46(4): 86-89.

[9] 李儀奎. 中藥藥理實驗方法學 [M]. 第2版. 上海: 上海科學技術出版社, 2006: 25.

[10] 張全鵬, 王慧, 陳旦, 等. 水合氯醛、烏拉坦及其1∶1混合液在SD大鼠麻醉中的效果比較及應用 [J]. 現代生物醫學進展, 2011, 11(7): 1208-1212.

[11] 孫潔, 楊兵全, 孫子林. 自噬與糖尿病骨骼肌病變 [J]. 國際內分泌代謝雜志, 2014, 34(3): 194-196.

[12] Urrea C, Mignogna A. Development of an expert system for pre-diagnosis of hypertension, diabetes mellitus type 2 and metabolic syndrome [J]., 2020, 26(4): 2776-2791.

[13] 馬文文, 劉康. 自噬與胰島素抵抗的相關性探討 [J]. 醫藥前沿, 2019, 9(3): 107-108.

[14] Choi J W, Ohn J H, Jung H S,. Carnitine induces autophagy and restores high-fat diet-induced mitochondrial dysfunction [J]., 2018, 78: 43-51.

[15] Bloemberg D, Quadrilatero J. Autophagy, apoptosis, and mitochondria: Molecular integration and physiological relevance in skeletal muscle [J]., 2019, 317(1): C111-C130.

[16] Yadav A, Singh A, Phogat J,. Magnoflorine prevent the skeletal muscle atrophy via Akt/mTOR/FoxO signal pathway and increase slow-MyHC production in streptozotocin-induced diabetic rats [J]., 2021, 267: 113510.

[17] Lenoir O, Tharaux P L, Huber T B. Autophagy in kidney disease and aging: Lessons from rodent models [J]., 2016, 90(5): 950-964.

[18] 李恩, 葉魁, 孫君志, 等. 8周游泳運動對高脂飲食誘導胰島素抵抗大鼠骨骼肌細胞自噬的影響 [J]. 成都體育學院學報, 2019, 45(4): 121-126.

[19] Chang H, Peng X, Yan X,. Autophagy and Akt-mTOR signaling display periodic oscillations during torpor-arousal cycles in oxidative skeletal muscle of Daurian ground squirrels () [J]., 2020, 190(1): 113-123.

[20] Brandt N, Gunnarsson T P, Bangsbo J,. Exercise and exercise training-induced increase in autophagy markers in human skeletal muscle [J]., 2018, 6(7): e13651.

[21] 張新鵑, 王海鳳, 孫永顯, 等. 蒲公英水提取物對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用研究 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2021, 32(1): 17-22.

[22] 蔡晟宇, 李佑生. 桑葉提取物調控IRS-1/PI3K/GLUT4通路影響2型糖尿病胰島素抵抗機制研究 [J]. 新中醫, 2020, 52(1): 1-6.

Effect of Shuangqing Pinghua Recipe on autophagy pathway protein expressions in skeletal muscle of rats with metabolic syndrome

FU Wen-hao1,2, TIAN Chun-yu1, LA Xiao-jin1, ZHANG Guo-wei1, ZHANG Min1, WANG Yao-yao1, CHEN Rui-jun1, WANG Xiu-ping3, LI Ji-an1

1. Hebei Provincial Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Diabetes and Its Complications, Traditional Chinese Medicine College, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China 2. Shexian Hospital of Traditional Chinese Medicine, Handan 056400, China 3. Institute of Coastal Agriculture, Hebei Academy of Agriculture andForestry Sciences, Tangshan 063210, China

To observe the effects of Shuangqing Pinghua Recipe (雙清平化方, SPR) on Lee’s index, blood glucose, blood lipids and mammalian target of rapamycin (mTOR), Beclin1 and microtubule-associated protein1 light chain 3 (LC3) protein expressions in skeletal muscle of rats with metabolic syndrome, and explore the mechanism of SPR on improving glucose and lipid metabolism.A high-fat diet with 10% fructose water was fed and combined with the application of-nitro--arginine methyl ester (-NAME) and streptozotocin (STZ) to induce metabolic syndrome model. Rats with metabolic syndrome were treated with SPR or metformin for 8 weeks, rats were periodically tested for body weight, body length, abdominal circumference, blood pressure and glucose tolerance, glycosylated hemoglobin (GHb), insulin (INS), total cholesterol (TC), and triglycerides (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), and area under the glucose curve (OGTT-AUC) and insulin resistance index (HOMA-IR) were calculated. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of skeletal muscle tissue; Masson staining was used to observe the morphological changes of skeletal muscle fibers; Immunohistochemistry was used to detect the expression of LC3 protein in skeletal muscle tissue; Western blotting was used to detect mTOR, Beclin1 and LC3 protein expressions in skeletal muscle tissue.Compared with control group, fasting blood glucose (FBG), 2 h postprandial glucose (PG2h), OGTT-AUC, HOMA-IR, INS, GHb, TC, TG and LDL-C levels were significantly increased (< 0.01), HDL-C level was significantly decreased (< 0.01) in model group, mTOR protein expression in skeletal muscle tissues was significantly up-regulated (< 0.01), Beclin1 and LC3 protein expressions were significantly down-regulated (< 0.01). Compared with model group, FBG, PG2h, OGTT-AUC, HOMA-IR, INS, GHb, TC, TG and LDL-C levels in SPR group were significantly decreased (< 0.05, 0.01), HDL-C level was significantly increased (< 0.01), mTOR protein expression in skeletal muscle was significantly up-regulated (< 0.01), Beclin1 and LC3 protein expressions were significantly down-regulated (< 0.01).SPR can improve insulin resistance, improve glucose and lipid metabolism, and inhibit the pathological changes of skeletal muscle in rats with metabolic syndrome. Its mechanism may be related to regulating skeletal muscle autophagy and activating mTOR, Beclin1 and LC3 protein expressions.

Shuangqing Pinghua Recipe; metabolic syndrome; skeletal muscle; autophagy; insulin resistance

R285.5

A

0253 - 2670(2022)19 - 6108 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.017

2022-04-28

科技部對發展中國家常規性科技援助項目（KY201904005）；唐山市糖尿病中西醫結合防治團隊（19130205C）

付文浩（1988—），男，碩士研究生，研究方向為中醫藥防治代謝綜合征。Tel: 15369076939 E-mail: begoodful@163.com

李繼安，博士生導師，教授，主要從事內分泌、糖脂代謝研究。E-mail: lnyy@vip.sina.com

[責任編輯 李亞楠]