2021 年北京市獸醫實驗室非洲豬瘟病毒核酸檢測能力比對

吳 迪，杜 鵑，王 林，史 記，程敏姮，趙浩軍，周德剛，吳惠明

（北京市動物疫病預防控制中心，北京 102629）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒感染家豬和野豬引起的一種廣泛出血性、高度接觸性傳染病，其特征為病程短，呈最急性和急性感染，死亡率可達100%[1]，是全球公認的養豬業第一殺手。世界動物衛生組織（WOAH）將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[2]。

2018 年非洲豬瘟疫情在北京市暴發，北京市動物疫病預防控制中心共委托17 家獸醫實驗室開展非洲豬瘟病毒核酸檢測工作，包括區級獸醫實驗室10 家，非洲豬瘟第三方授權實驗室7 家。實驗室間能力比對是評價實驗室檢測水平的重要手段[3]。2021 年，根據《農業農村部辦公廳關于做好非洲豬瘟實驗室檢測工作的通知》（農辦牧〔2018〕54號）[4]、《農業農村部辦公廳關于進一步做好非洲豬瘟實驗室檢測工作的通知》（農辦牧〔2018〕66號）[5]等文件要求，北京市動物疫病預防控制中心組織17 家獸醫實驗室開展了非洲豬瘟病毒核酸檢測能力比對工作。本研究依據《利用實驗室間比對進行能力驗證的統計方法》（GB/T 28043—2019）[6]，對各實驗室非洲豬瘟病原學檢測結果進行了統計分析，以期為深度挖掘實驗室檢測數據，持續提升實驗室檢測能力奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 參加能力比對獸醫實驗室

2021 年，北京市動物疫病預防控制中心組織10 家區級獸醫實驗室與7 家非洲豬瘟第三方授權實驗室開展非洲豬瘟病毒核酸檢測能力比對試驗，北京市動物疫病預防控制中心實驗室對盲樣進行了檢測。共計獲得18 家獸醫實驗室檢測數據，實驗室編號為1～18。

1.2 試驗設計與參比項目

1 000 copies/μL（Ct=29）、100 copies/μL（Ct=33）與陰性對照3 種比對質控樣品，由中國動物衛生與流行病學中心非洲豬瘟國家參考實驗室提供。每組設置6 份盲樣，其中1 000 copies/μL 比對盲樣2 份，100 copies/μL 比對盲樣3 份，陰性比對盲樣1 份。每組盲樣獨立包裝并置于-20 ℃保存。

參比項目為非洲豬瘟病毒熒光定量PCR 檢測。各實驗室統一領取比對盲樣，統一選用青島立見診斷技術發展中心非洲豬瘟病毒熒光PCR 檢測試劑盒作為比對試驗診斷試劑，檢測標準參照試劑盒說明書。

1.3 數據處理

依據文獻[6]，分別采用箱線圖、穩健統計Z比分數、堯敦圖等統計方法，對各實驗室非洲豬瘟病原學檢測結果進行統計分析。

1.3.1 頻率分布直方圖 以18 家獸醫實驗室100 copies/μL 與1 000 copies/μL 比對盲樣檢測數據為基礎，繪制頻率分布直方圖，檢驗檢測數據是否符合正態分布。若符合正態分布，則利用平均值±標準差對18 家參比實驗室的檢測結果進行統計分析。

1.3.2 箱線圖 以18 家獸醫實驗室100 copies/μL與1 000 copies/μL 比對盲樣檢測數據為基礎，統計中位數、均值、組間SD、組間CV 等數據，繪制箱線圖，反映數據分布的中心位置和散布范圍。

1.3.3 穩健統計Z比分數 以18 家獸醫實驗室100 copies/μL 與1 000 copies/μL 的比對盲樣檢測數據為基礎，計算Z比分數，公式為

式中，Z代表獸醫實驗室的檢測結果xi與平均值x的偏離程度。|Z|≤2，結果判定為滿意；2 ＜|Z|＜3，結果判定為可疑，需要查找原因；|Z|≥3，結果判定為不滿意，需要查找原因整改。s代表標準偏差。符號“+”與“-”代表xi與平均值x的偏離方向。

1.3.4 堯敦圖 以18 家獸醫實驗室1 000 copies/μL的比對盲樣Z比分數為X軸，以100 copies/μL 比對盲樣Z比分數為Y軸，畫出垂直線和水平線，創建四個象限，輔助進行數據分析。檢查圖中遠離數據中心的點，若實驗室未遵循正確檢測方法，其結果會受系統誤差影響，存在較大偏倚，會在左下象限和右上象限出現遠離點；若實驗室出現隨機誤差，會在左上象限和右下象限出現遠離點。

2 結果與分析

2.1 頻率分布直方圖

頻率分布直方圖（圖1）顯示，18 家實驗室的100 copies/μL 與1 000 copies/μL 比對盲樣檢測數據均呈近似正態分布。

圖1 盲樣頻率分布直方圖

2.2 核酸檢測比對

對18 家參比實驗室檢測的盲樣結果進行統計分析，盲樣標定為1 000 copies/μL 與100 copies/μL，取平均值±標準差作圖。結果（圖2）顯示，盲樣標定為100 copies/μL 時，編號16 號實驗室標準差相比其他實驗室較高。

圖2 18 家實驗室非洲豬瘟病毒核酸檢測比對結果

2.3 箱線圖

箱線圖結果（圖3）顯示，在1 000 copies/μL盲樣檢測中無異常點，在100 copies/μL 盲樣檢測中存在一個異常點，結合表1，顯示異常Ct 為45.000。

表1 不同濃度盲樣比對結果分析

圖3 箱線圖結果（異常值用紅點標出）

2.4 穩健統計Z 比分數

結果（圖4）顯示，全部36 份1 000 copies/μL比對盲樣檢測結果中，結果判定為滿意的有35 份，占97.2%；可疑樣品1 份，來自3 號實驗室，Z值為-2.25。

圖4 18 家實驗室1 000 copies/μL 比對盲樣Z 比分數分布

結果（圖5）顯示，全部54 份100 copies/μL比對盲樣檢測結果中，結果判定為滿意的有52 份，占96.3%；可疑樣品1 份，來自3 號實驗室，Z值為-2.04；不滿意樣品1 份，來自16 號實驗室，Z值為4.43。

圖5 18 家實驗室100 copies/μL 比對盲樣Z 比分數分布

2.5 堯敦圖

結果（圖6）顯示，16 號實驗室在95%置信橢圓外，出現在右上象限，顯示已離群，提示該實驗室出現系統誤差。

圖6 18 家實驗室比對樣品Z 值堯敦圖

3 討論

本次區級獸醫實驗室非洲豬瘟病毒核酸檢測能力比對結果顯示：16 號實驗室的1 份標定為100 copies/μL 的盲樣檢測Ct 為45.000，且無擴增曲線，結合檢測標準（當Ct ≥40 時判為陰性），判定檢測結果不合格，其余17 家檢測結果均為符合。雖然17 家檢測結果為符合的實驗室在本次能力比對中陰陽性結果判定正確，但一些實驗室也存在檢測結果預警情況。其中12、15 號實驗室在100 copies/μL 盲樣檢測中重復性較差，標準偏差較大，但在1 000 copies/μL 盲樣檢測中重復性較好，標準偏差較小。4、11、13 號實驗室在1 000 copies/μL 盲樣檢測中重復性較差，但在低濃度100 copies/μL 盲樣檢測中重復性較好。8 號實驗室在1 000 copies/μL 與100 copies/μL 盲樣檢測中標準偏差均較大，樣品重復性較差。

堯敦圖檢測結果可以反映實驗室的系統誤差與隨機誤差，含有明顯系統誤差的實驗室將在右上象限（正偏差）與左下象限（負偏差）出現偏離點，即檢測的兩個樣品結果會同時出現異常高值或低值；而隨機誤差將在左上象限與右下象限出現偏離點，即一個樣品的檢測值高，另一個樣品的檢測值低。比對本次18 家實驗室檢測結果發現，16 號實驗室已離群，存在明顯系統誤差，11、12 號實驗室存在隨機誤差，建議在下輪比對試驗中持續跟蹤。3 號實驗室在1 000 copies/μL 樣品Z比分數為-2.25，在100 copies/μL 樣品Z比分數為-2.04，均顯示可疑，但3 號實驗室的檢測Ct 值較其他實驗室比較靠前，可能是因為3 號實驗室采用核酸提取方法提取效率較高。

本研究依據《利用實驗室間比對進行能力驗證的統計方法》（GB/T 28043—2019）中能力計量的評定運算，采用箱線圖、穩健統計Z比分數、堯敦圖等統計方法，對各實驗室比對數據進行了統計分析，使區級獸醫實驗室非洲豬瘟病毒核酸檢測比對不僅可以依靠陰陽性結果進行判讀，還可以通過統計方法深度分析出各實驗室的系統誤差與隨機誤差。結果提示，各實驗室應持續加強質量控制，保持和提高實驗室檢測能力水平。