貓傳染性腹膜炎病毒熒光定量RT-PCR 檢測方法的建立

楊 妮，韓佃剛，楊云慶，葉玲玲，李 靜，周思佳，宿 放，艾 軍，信吉閣

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；2.昆明海關(guān)技術(shù)中心，云南昆明 650200）

貓傳染性腹膜炎（feline infectious peritonitis，F(xiàn)IP）是一種由貓傳染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV）感染引起的病毒性傳染病，主要臨床癥狀表現(xiàn)為腹膜炎、腹腔積液及各類臟器腫大[1]，是影響?zhàn)B貓業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。FIPV 屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為不分節(jié)段的RNA 病毒，基因組全長29.2 kb，其病毒蛋白包括4種結(jié)構(gòu)蛋白[棘突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）]，5 種輔助蛋白（3a、3b、3c、7a、7b）及2 種非結(jié)構(gòu)蛋白（1a 和1b）[2]。其中，編碼M 蛋白和N 蛋白的基因相對(duì)保守，適合作為FIPV 檢測的分子靶標(biāo)[3]。

FIP 常用的診斷方法有臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷。臨床診斷取決于診斷者經(jīng)驗(yàn)及患病貓的臨床表現(xiàn)，患病貓初期臨床癥狀不明顯，病程進(jìn)展有較大差異，常因誤診而貽誤治療，最終導(dǎo)致病貓死亡。實(shí)驗(yàn)室診斷包括病理學(xué)檢查、血清學(xué)檢測和病原學(xué)檢測等[4]。病理學(xué)檢測耗時(shí)較長，制作復(fù)雜；血清學(xué)檢測適合于滲出型FIP，對(duì)于非滲出型FIP 存在一定的局限性；常規(guī)RT-PCR 檢測靈敏度低，容易出現(xiàn)假陰性，熒光定量RT-PCR 方法與常規(guī)RT-PCR 檢測方法相比，具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。本研究以FIPVN基因?yàn)榘行蛄校O(shè)計(jì)合成特異性引物及TaqMan 探針，建立了一種FIPV 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測方法，并對(duì)該方法的特異性、靈敏度和重復(fù)性進(jìn)行了試驗(yàn)，以期為提高FIPV 檢測效率和FIPV 精準(zhǔn)防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 狂犬病毒（RV）、貓皰疹病毒（FHV）、貓杯狀病毒（FCV）、貓細(xì)小病毒（FPV）、犬流感病毒（CIV）、犬瘟熱病毒（CDV），由昆明海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 病毒RNA/DNA 提取試劑盒，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；One step qRT-PCR Probe Kit，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；StepOne Plus Real-Time PCR System，購自ABI 公司；PUC57-FIPV-N重組質(zhì)粒，由昆明擎科生物科技有限公司合成；5430R 高速臺(tái)式離心機(jī)，購自德國Eppendorf 公司；-80 ℃冰箱，購自日本SANYO 公司。

1.1.3 引物和探針設(shè)計(jì) 下載GenBank 公布的FIPVN基因序列，利用DNAMAN 生物學(xué)信息軟件分析其保守區(qū)域，用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan 探針（表1），送至昆明擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒核酸提取 按照RNA/DNA 提取試劑盒操作說明書分別提取FIPV、RV、FCV、CIV、CDV 的RNA 和FHV、FPV 的DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 反應(yīng)體系優(yōu)化及擴(kuò)增條件 以陽性重組質(zhì)粒為模板，最低檢測Ct 值為標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化熒光定量RT-PCR 反應(yīng)條件。反應(yīng)體系20.0 μL：上下游引物各0.4 μL，TaqMan 探針0.2 μL，2×RT-PCR Buffer 10.0 μL、25×RT-PCR Enzyme Mix 1.0 μL、50×Rox 0.4 μL、模板1.0 μL，用ddH2O 補(bǔ)充總體積至20.0 μL。參照酶的說明書設(shè)置引物濃度為10 pmol/μL，調(diào)整探針濃度分別為2、5、10 μmol/L。擴(kuò)增條件：55 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s（此步驟收集熒光信號(hào)），45 個(gè)循環(huán)。

1.2.3 特異性試驗(yàn) 采用建立的熒光定量RT-PCR 檢測方法，分別對(duì)FIPV、RV、FCV、CIV、CDV、FHV、FPV 核酸進(jìn)行檢測，評(píng)價(jià)方法的特異性。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和靈敏度試驗(yàn) 使用微量核酸蛋白分析儀測定標(biāo)準(zhǔn)陽性重組質(zhì)粒濃度，根據(jù)公式計(jì)算拷貝數(shù)（拷貝數(shù)=6.02×1023×DNA濃度/質(zhì)量MW，MW=DNA 堿基數(shù)×330），得到拷貝數(shù)濃度為3.4×1011copies/μL。對(duì)陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋，使?jié)舛确秶鸀?.4×108～3.4×101copies/μL。采用建立的熒光定量RT-PCR 檢測方法，對(duì)上述系列稀釋樣品進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并評(píng)價(jià)方法的靈敏度。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 選取拷貝數(shù)濃度為3.4×108、3.4×106、3.4×104、3.4×102copies/μL的陽性質(zhì)粒，采用同批次配制的熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，每個(gè)模板設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)；采用不同批次配制的熒光定量RT-PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，每個(gè)模板設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算批間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性。變異系數(shù)計(jì)算公式為CV=（標(biāo)準(zhǔn)偏差SD/平均值Mean）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)體系優(yōu)化

結(jié)果（圖1）顯示，最終確定探針濃度為10 μmol/L。優(yōu)化后的反應(yīng)體系：2×RT-PCR Buffer 10.0 μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 1.0 μL，上 下游引物（10 pmol/μL）各0.4 μL，TaqMan 探針0.2 μL，50×Rox 0.4 μL，模板1.0 μL，用ddH2O補(bǔ)充總體積至20.0 μL。

圖1 探針濃度優(yōu)化結(jié)果

2.2 特異性試驗(yàn) 利用建立的熒光定量PCR 檢測方法分別對(duì)FIPV、RV、FCV、CIV、CDV、FPV、FHV 核酸進(jìn)行檢測。結(jié)果（圖2）顯示，該方法僅對(duì)FIPV 有特異性擴(kuò)增，而對(duì)上述其他病毒均無擴(kuò)增，表明該方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和靈敏度試驗(yàn) 采用熒光定量RT-PCR 方法檢測系列稀釋的陽性重組質(zhì)粒，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的Ct 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=38.445 0 -3.308 3x，可信度（R2）為0.998 9，擴(kuò)增效率（E）為100.5%（圖3）。對(duì)陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋，評(píng)價(jià)方法的靈敏度，結(jié)果（圖4）顯示，當(dāng)陽性質(zhì)粒拷貝數(shù)濃度為3.4 copies/μL 時(shí)，仍可見明顯擴(kuò)增曲線，表明本檢測方法對(duì)FIPV 的檢測靈敏度為3.4 copies/μL。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 選取3.4×108、3.4×106、3.4×104、3.4×102copies/μL 的陽性質(zhì)粒模板，用本試驗(yàn)建立的熒光定量RT-PCR 方法進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)性測試。結(jié)果（表2）顯示，該方法的批內(nèi)變異系數(shù)為0.99%～4.13%，批間變異系數(shù)為1.29%～4.64%，表明該方法重復(fù)性較好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

FIPV 于1963 年被首次報(bào)道，目前其檢測方法仍在不斷發(fā)展中，特別是在貓沒有出現(xiàn)體腔積液的情況下[7]。FIP 常用的診斷方法包括病理學(xué)檢測、血清學(xué)檢測、免疫組織學(xué)檢測和RT-PCR 檢測等[8]。RT-PCR 方法是擴(kuò)增和檢測核酸的技術(shù)，但其靈敏度低，當(dāng)腹腔積液中FIPV 含量較少時(shí)，容易造成漏檢，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 技術(shù)具有高效、快速、定量檢測病原核酸等優(yōu)勢[9]，已廣泛應(yīng)用于多種病原的檢測工作。熒光定量RT-PCR 分為染料法和探針法，熒光染料如SYBR Green I 能直接與DNA 雙鏈結(jié)合，結(jié)合后產(chǎn)生的熒光信號(hào)可被儀器監(jiān)測，熒光強(qiáng)度與DNA 含量成正比，但由于熒光染料能夠結(jié)合反應(yīng)體系里所有的dsDNA 雙螺旋小溝區(qū)域，因此特異性不如探針法強(qiáng)，且對(duì)引物的特異性要求很高[10]。探針法是在上下游引物之間插入一條熒光標(biāo)記探針，熒光探針與目的模板特異性結(jié)合，可大幅提高檢測特異性和靈敏度。

目前已有相關(guān)學(xué)者建立了FIPV 熒光定量RT-PCR 檢測方法。如：王元紅等[11]針對(duì)FIPVN基因設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物，通過條件優(yōu)化，建立了一種FIPV 的SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，其最低檢出量為102copies/μL，靈敏度低于本研究建立的探針法；Dunbar 等[12]建立了一種從腸系膜淋巴結(jié)、細(xì)針抽吸物中檢測非滲出性FIPV的熒光定量RT-PCR 檢測方法，敏感性為90.0%，特異性為96.1%，使非滲出性FIPV 檢測成為可能；Fish 等[3]用雙標(biāo)記寡核苷酸TaqMan 探針熒光定量RT-PCR 方法對(duì)205 只貓樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了1 例陽性病例；Doenges 等[5]評(píng)估了熒光定量RT-PCR 方法檢測貓外周血單個(gè)核細(xì)胞、血清和無細(xì)胞體腔積液的靈敏性和特異性，結(jié)果顯示該方法特異性為100%。

本研究建立的TaqMan 熒光定量PCR 方法靈敏度高，最低檢測限為3.4 copies/μL；特異性強(qiáng)，與RV、FHV、FCV、FPV、CIV、CDV等均無交叉反應(yīng)；重復(fù)性好，批內(nèi)變異系數(shù)為0.99%～4.13%，批間變異系數(shù)為1.29%～4.64%，可成為FIPV 快速有效的檢測手段。