兩種H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 試劑盒的敏感性和特異性評價

馮肖肖，趙靈燕，劉 霞，黃 靖，陳偉良，董建斐，張 璐，徐 輝

（浙江省動物疫病預防控制中心，浙江杭州 310000）

2013 年我國首次報告人H7N9 流感病例[1-3]。2017 年初我國首次檢測到對家禽呈高致病力的H7N9 流感病毒，其傳播力強、致死率高，給國內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[4-9]。2017 年秋季我國開始實施家禽H5 和H7 亞型流感全面免疫政策，有效防控了H7N9 流感的傳播與流行。家禽H7N9 流感強制免疫效果和病原污染狀況日常監(jiān)測是H7N9 流感防控的重要工作內(nèi)容[10-11]。目前，H7N9 流感日常監(jiān)測和防控普遍采用商品化熒光RT-PCR 試劑盒。而市場上商品化的H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 檢測試劑盒種類眾多，不同試劑盒的陰陽性臨界點判定標準不同，導致臨床檢測結果存在較大差異。因此，本研究選擇兩種H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 檢測試劑盒，對50 份樣品進行檢測，采用TG-ROC 方法分析其敏感性和特異性，并用Kappa 一致性檢驗評估檢測結果的一致性，綜合評價其檢測性能，為H7N9 流感病毒檢測試劑盒的選擇和應用提供依據(jù)和指導。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品

浙江省在2016—2017 年日常監(jiān)測中檢出50份疑似H7N9 流感核酸陽性樣品，已通過官方報備并送國家禽流感參考實驗室，經(jīng)國家禽流感參考實驗室通過雞胚病毒分離鑒定，確認其中11 份為H7N9 流感病毒陽性，其余39 份為陰性。

1.2 主要儀器與試劑

兩種H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 檢測試劑盒分別購自A、B 兩家生物科技有限公司，分別標記為A、B 試劑盒。A 和B 兩種試劑盒提供的臨界點判定值分別為43 和30。

Roche480 熒光定量PCR 儀、MagNA Pure 96全自動核酸提取儀，均購自Roche 公司。

1.3 熒光RT-PCR 檢測

按照核酸提取試劑盒說明書提取樣品核酸，分別用A、B 兩種試劑盒進行H7N9 流感病毒核酸檢測，結果判定依據(jù)試劑盒說明書標準。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計分析兩種熒光RT-PCR 檢測試劑盒的檢測結果，并以雞胚病毒分離鑒定結果作為“金標準”，采用TG-ROC 分析方法篩選熒光RT-PCR最適Ct 值（閾值），以2×2 列聯(lián)表分析兩種檢測試劑盒的敏感性和特異性。敏感性=真陽性數(shù)/（真陽性數(shù)+假陰性數(shù)）×100%；特異性=真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)+假陽性數(shù)）×100%。對檢測結果用Kappa 一致性檢驗評估其一致性，綜合評價兩種試劑盒的檢測性能。其中，Kappa ＜0.2 說明一致性較差，0.2～0.4 說明一致性一般，0.4～0.6 說明一致性中等，0.6～0.8 說明一致性較強，0.8～1.0 說明一致性很強。

2 結果與分析

2.1 核酸檢測

采用兩種H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 檢測試劑盒分別對50 份拭子樣品進行檢測，按照試劑盒提供的臨界點判定閾值。結果（表1、2）顯示：A試劑盒檢出27 份陽性、23 份陰性，以雞胚病毒分離鑒定結果為“金標準”，則A 試劑盒的敏感性和特異性分別為90.9%（10/11）和56.4%（22/39），敏感性高，但特異性低；B 試劑盒共檢出8 份陽性，其余42 份為陰性，以雞胚病毒分離鑒定結果為“金標準”，則B 試劑盒的敏感性和特異性分別為54.5%（6/11）和94.9%（37/39），特異性高，但敏感性低。

表1 A 試劑盒與病毒分離鑒定法的檢測結果比較 單位：份

表2 B 試劑盒與病毒分離鑒定法的檢測結果比較 單位：份

2.2 一致性比較

Kappa 一致性檢驗結果（表3）顯示：兩種檢測試劑盒的Kappa 值為0.28，一致性一般，說明A 和B 兩種熒光RT-PCR 檢測試劑盒對H7N9 流感病毒的檢測結果差異較大。

表3 兩種熒光RT-PCR 檢測試劑盒的檢測結果比較 單位：份

2.3 TG-ROC 分析曲線

敏感性和特異性相等時所對應的Ct 值為最佳閾值，這個點恰好是敏感性和特異性曲線的交點[12-14]。TG-ROC 分析曲線（圖1）顯示：A試劑盒閾值為33，對應的敏感性和特異性分別為90.91%和92.31%；B 試劑盒閾值為37，對應的敏感性和特異性分別為81.82%和87.18%。

圖1 兩種試劑盒TG-ROC 分析曲線

2.4 判定標準重設后檢測

A 試劑盒原定的判定標準（Ct）為43，該閾值下的敏感性達到最高，但特異性較差。若將判定標準調整至33～35，其敏感性不變，但特異性大大提高。因此，根據(jù)TG-ROC 分析曲線，重新設定A 試劑盒判定標準為33。調整后的檢測結果（表4）顯示，與“金標準”相對比，A 試劑盒的敏感性和特異性分別為90.91%（10/11）和92.31%（36/39），均達到90%以上，與調整前相比，敏感性不變，但特異性提高了35.91 百分點。

表4 A 試劑盒調整判定標準后的檢測結果對比 單位：份

B 試劑盒原定的判定標準（Ct）為30，該閾值下的特異性較高，但敏感性較差。若將臨界點調整至36～37，不僅特異性保持較好，且敏感性大大提高。因此，根據(jù)TG-ROC 分析曲線，重新設定B 試劑盒判定標準為37。調整后檢測結果（表5）顯示，與“金標準”相對比，B 試劑盒的敏感性和特異性分別為81.82%（9/11）和87.18%（34/39），均在80%以上。與調整前相比，特異性雖然下降7.72 百分點，但敏感性提高了27.32 百分點。

表5 B 試劑盒調整判定標準后的檢測結果對比 單位：份

2.5 判定標準重設后檢測結果一致性

調整判定標準后兩種試劑盒檢測一致性比較結果（表6）顯示，兩種檢測試劑盒的Kappa 值為0.85，一致性很強，說明兩種試劑盒檢測結果一致。

表6 兩種試劑盒調整判定標準后檢測結果一致性比較 單位：份

3 討論

高致病性H7N9 流感是我國重點防控的人獸共患傳染病之一[2-3，5]。H7N9 流感病毒屬于RNA病毒，極易發(fā)生基因突變和重組，因此病原變異監(jiān)視是防控高致病性禽流感的重要工作。目前，熒光RT-PCR 檢測技術是H7N9 流感病原檢測的常用方法之一[10，15]，可實時、快速地監(jiān)視其分布和流行情況，在高致病性禽流感防控監(jiān)測工作中得到廣泛應用。不同廠家的H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 檢測試劑盒判定標準不同，導致其最終檢測結果也不一致。因此，在實際應用中，應根據(jù)不同監(jiān)測目的和要求，選擇不同敏感性和特異性的試劑盒。ROC曲線，也稱受試者工作特征曲線，最初運用在軍事上，1971 年被推廣到醫(yī)學界后得到廣泛應用，主要用于診斷試驗的綜合評價[12-13]。1995 年德國學者首次對ROC 曲線進行改進，并提出TG-ROC 分析方法，也稱雙圖受試者工作特征曲線[12]。通過計算診斷試劑每個閾值對應的敏感性和特異性，以閾值為橫坐標，敏感性和特異性為縱坐標，在同一個坐標系上繪制敏感性曲線和特異性曲線雙圖，其交點即為最佳閾值。TG-ROC 分析方法不僅可直觀地反映敏感性和特異性對閾值的影響，也可估計試驗結果準確度，還可以根據(jù)實際情況，選取最佳閾值作為判定標準，使試驗的敏感性和特異性達到實際要求，以獲得檢測試驗的最大準確度，因而常用來評價檢測試驗的可靠性，具有臨床指導意義[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩個廠家的H7N9 流感病毒熒光RT-PCR 檢測試劑盒的判定閾值不同，因而其敏感性和特異性也各不相同，導致檢測結果不一致。在實際應用中兩種試劑盒各有利弊：A 試劑盒敏感性較高，可以有效檢測病原，降低漏檢對防控造成的不利影響，但其特異性低，誤診率較高，實際應用中會導致假陽性較多，導致因疫情誤判而加大防控成本；而B 試劑盒特異性較高，可降低誤診引起的經(jīng)濟損失，但其敏感性低，難以有效檢測禽群中存在的H7N9 流感病毒，實際應用中會導致假陰性較多，漏檢率較高，可能造成防控漏洞而增加疫情發(fā)生風險。因此，在臨床應用中，應根據(jù)不同需求和檢測目的選擇合適的試劑盒。

診斷試驗中，恰當?shù)呐卸ㄩ撝悼商岣咴\斷的真實性，提高疫病防控能力，還可以防范漏檢、誤診帶來的危害。TG-ROC 分析結果顯示，在原定閾值下，A、B 兩種試劑盒只能滿足敏感性高或特異性高之一的特性，而不能同時達到最佳敏感性和特異性要求，不利于實際應用和選擇。A、B 兩個試劑盒的判定閾值偏低或偏高，致使假陽性或假陰性偏多，容易造成誤判或漏檢，不僅會加大診斷處理成本或疫情風險，還會降低診斷試劑的綜合性能。通過TG-ROC 分析法計算診斷試劑的最佳閾值并重新調整后，A 試劑盒的敏感性和特異性同時達到90%以上，B 試劑盒能同時達到80%以上，且兩者檢測結果的一致性明顯增強。這表明，判定閾值會影響診斷試驗的可靠性和真實性。采用TG-ROC分析方法，選擇適當?shù)呐卸ㄩ撝担梢蕴岣邫z測試劑的敏感性和特異性，增加檢測結果的可靠性和真實性，減少漏診和誤診帶來的問題，從而幫助采取科學的疫病防控措施。

綜上所述，不同廠家試劑盒的檢測結果存在差異，實際應用中不同監(jiān)測目的要求的試劑盒敏感性和特異性也不同，因此可以應用TG-ROC 分析方法，選定檢測試劑盒的陰陽性臨界點，重新調整試劑盒判定標準，提高檢測方法在臨床檢測應用中的指導性。本試驗樣本數(shù)據(jù)有限，今后還需進一步積累數(shù)據(jù)進行深入研究。