凝集素在甲殼類動物免疫學方面的研究進展

封永輝，郭曉萌，邱 亮，董 宣

（1.新疆維吾爾自治區水產科學研究所，新疆烏魯木齊 830000；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，農業農村部海水養殖病害防治重點實驗室，青島市海水養殖流行病學與生物安保重點實驗室，山東青島 266071）

甲殼類動物作為無脊椎動物中一員，不具備脊椎動物獲得性免疫相關的B 淋巴細胞和T 淋巴細胞，但進化形成了完善抵御致病性生物的先天性免疫系統[1]，包括由幾丁質體表外殼、呼吸器官和消化器官組成的物理防御，血細胞組成的細胞免疫以及由各種免疫因子組成的體液免疫[2-3]。參與體液免疫的許多成分都存儲在血淋巴細胞中。甲殼類動物的體液免疫必須依賴血淋巴細胞參與，啟動依賴宿主模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）來識別病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）[4-5]。

凝集素作為識別PAMPs 的重要成員，在甲殼類動物細胞免疫識別病原過程中發揮巨大作用[6]。通過甲殼類動物凝集素的深入研究可以提升對甲殼類動物免疫系統的認識水平，對發展綠色健康漁業生產具有重要理論和現實指導意義，有助于從根本上提升漁業生產的防病治病水平。本文從凝集素定義、分類和功能等方面，總結凝集素在甲殼類動物免疫學方面的研究進展情況，并對其中研究較多的兩種重要類型——C 型凝集素（C-type lectins，CTLs）和纖維蛋白原樣結構域免疫凝集素（fibrinogen-like domain immunolectins，FBGLs）作出總結。

1 凝集素介紹

1.1 定義

1888 年，俄國Hermann Stillmark 研究蓖麻籽毒性時發現提取物可以凝集血細胞，并將該提取物命名為蓖麻蛋白（ricin）。1954 年，Boyd 建議使用拉丁文legere（意為選擇）命名，后因其能凝集紅血球（含血型物質），將其命名為凝集素。凝集素是從各種植物以及無脊椎動物和高等動物中提純的一種糖蛋白或結合糖的模式識別分子蛋白。1988年，Barondes 等將凝集素進一步定義為非酶和抗體的結合蛋白[7]。凝集素在自然界廣泛存在，植物、動物、微生物中都存在多種類型的凝集素。

1.2 分類及功能

根據物種來源，凝集素被分類為植物凝集素、動物凝集素、原生生物凝集素、細菌凝集素和病毒凝集素。

植物凝集素主要存在于豆科（Legumes）、石蒜科（Amaryllidaceae）、桑科（Moraceae）、覓科（Amaranthaceae）、大戟科（Euphorbiaceae）、茄科（Solanaceae）、唇形科（Labiatae）、尊麻科（Urticaceae）以及谷類（cereals）等植物中。植物凝集素參與植物體抵御病毒和昆蟲的免疫過程[8]。

1906 年，在牛血清中首次發現動物凝集素。目前根據其不同結構特征及特異性結合基序，動物凝集素被分為L 型、P 型（配體為甘露糖-6-磷酸鹽）、C 型、F 型、M 型、I 型、R 型、S 型（依賴巰基）凝集素以及幾丁質酶樣凝集素（chitinaselike lectins）、半乳糖苷結合凝集素（galactosidebinding lectins，galectins）、鈣連蛋白（calnexin，CNX）或鈣網蛋白（calreticulin，CRT）、內凝集素（intelectins）、唾液酸結合凝集素（siglecs）、纖維膠凝蛋白（ficolins）、F-box 凝集素等[9-10]。動物凝集素能識別病原分子物質[11]，并調節蛋白折疊和調控細胞信號通路轉導等過程。

細菌凝集素分為可溶性凝集素、表面凝集素和菌毛凝集素。在功能方面，細菌凝集素擁有識別作用，與吞噬細胞結合可參與調節吞噬過程等[12]，也可參與多種生命活動，如早期胚胎發育和先天免疫。根據分布部位不同，細菌凝集素發揮的作用也不相同。一般胞內凝集素主要用于合成和分泌蛋白，而在胞外或胞膜上的凝集素則可能有參與病原識別和細胞信號轉導，觸發一系列免疫反應的作用，如引發免疫系統內血淋巴細胞對病原的吞噬及消滅作用。常見的細菌凝集素包括來自革蘭氏陰性菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），來自革蘭氏陽性菌的肽聚糖（peptidoglycans，PGN）和脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA），來自真菌的甘露聚糖（mannans）、β-1,3-葡聚糖和來自病毒的雙鏈RNA（dsRNA）或糖蛋白[13]。

無脊椎動物體內普遍存在凝集素[14]，其發現相對于植物凝集素要晚，相對于動物凝集素要早，可以追溯到1903 年。有研究[14]提到Noguchi 首次在無脊椎動物鱟（Limulus pohyphmus）體液中發現無脊椎動物凝集素，其主要發揮先天免疫功能。甲殼類動物凝集素相對于貝類動物凝集素結構更為復雜，是一種重要的免疫分子蛋白，在體液免疫中發揮識別PAMPs 的作用。甲殼類動物凝集素可以同時參與多項免疫反應，如參與病原識別、結合、凝集，激活酚氧化酶原激活系統（prophenoloxidase activating system，proPO）[15]，作為調理素參與細胞吞噬等。Vasta 等[16]研究發現，昆蟲、線蟲、海膽、七腮鰻、魚類和兩棲類動物中的凝集素主要發揮先天性免疫功能，在細胞間、細胞與胞外基質間相互作用，以及在糖蛋白的轉移、蛋白折疊、信號轉導、受精和發育中發揮重要作用。

目前在甲殼類動物中研究發現的凝集素包括C 型、L型、M 型、CNX 或CRT、甘露糖苷結合凝集素（mannose-binding lectin，MBL）、galectins、革蘭氏陰性菌結合蛋白（gram-negative binding proteins，GNBP）、含硫脂蛋白（thioestercontaining proteins）、清道夫受體（scavenger receptors）、絲氨酸蛋白酶同系物、唐氏綜合征細胞粘附分子（down syndrome cell adhesion molecule，Dscam）、FBGLs[9-10，17-20]（表1），其中C 型凝集素是甲殼類動物凝集素研究中的典型代表。

2 兩種重要甲殼類動物凝集素研究概況

2.1 C型凝集素

C型凝集素是最早發現的動物凝集素之一。1983 年McFaelane 首先發現肝去唾液酸糖蛋白受體（hepatic asialoglycoprotein receptor，ASGPR）。該受體被鑒定為動物C型凝集素。C型凝集素被認為是一類配體依賴鈣離子識別糖類型結合蛋白，因凝集需要活性鈣離子（Calcium）而得名。它含有一個或多個糖類識別結構域（carbohydrate recognition domain，CRD）或C 型凝集素樣結構域（C-type lectin like domain，CTLD），凡是含有與CRD/CTLD 相似的蛋白統稱為C 型凝集素[97]。C 型凝集素超家族包括膠原凝素（collectins）、選擇素（selectins）、胞吞作用受體（endocytic receptors）和蛋白聚糖（proteoglycans）。其主要特征是含有大約幾十到幾百個氨基酸序列。CRD/CTLD 結構域數目對其系統進化起了重要作用[9]。C型凝集素大多數是保守的，只包含1 個CRD；通過晶體分析揭示，CRD/CTLD 是一個特殊的壓縮球狀結構。目前研究發現，C 型凝集素也含有多個CRD，有的雖然具有CTLD，但不具備糖類結合能力。C型凝集素種類豐富，目前有1 000 多個。在脊椎動物中，根據結構和功能將C型凝集素分為Ⅰ—ⅩⅦ共17 組，幾乎在所有的多細胞生物中都能被發現[98]。

甲殼類動物C型凝集素組織分布具有物種和組織表達特異性（表1）。多方面研究表明，表達最豐富的組織是肝胰腺、血細胞、鰓、胃、腸道、心臟等免疫相關組織，但在不同病原刺激下，表達量有很大差異，如在凡納濱對蝦（L.vannamei）中發現的LvLT 和斑節對蝦（P.monodon）中發現的PmAV 和PmLT，在肝胰腺、血細胞中表達量較多[35，44-45]，LvCTL 在胃、腸道中少量表達；在中國明對蝦（F.chinensis）中發現的FcLec 僅表達于血細胞[38]，FcLec1、FcLec2[33，39]在 胃、腸道中少量表達；在克氏原螯蝦（P.clarkii）中提取的PcLec1 在鰓中的表達水平最高，而在血細胞中則非常低[63]；日本沼蝦（M.nipponensis）中的MnCTLDcp1 和MnCTLDcp2 在心臟中表達量最高，而MnCTLDcp3 在肝胰腺中高表達；羅氏沼蝦（M.rosenbergii）中的MrLec3 在肝胰腺、鰓、胃和腸中表達量最高，MrCTL 和MrERGIC-53 在血細胞、肝胰腺、腸道、胃中的表達量最高[21]。閻德平等[80]對三疣梭子蟹（P.trituberculatus）C 型凝集素PtCTL5 研究發現，其在血細胞中的表達量最高，肝胰腺中次之。從不同組織中發現，C 型凝集素發揮著不同的功能，如在凡納濱對蝦（L.vannamei）中，參與了對蝦神經系統發育的LvCTLD、LvLec在腦神經節中表達水平遠高于在肝胰腺和血細胞中，分析認為其可能在維持腦穩態中發揮著作用，而LvLec1 和LvLec2 卻在肝胰腺、肌肉、生殖腺、血液和鰓中都能表達[99]。王敏等[25]對秀麗白蝦（E.modestus）研究發現，EmCTL-1 主要在血液中表達，EmCTL-2 主要在性腺、血液和胸神經節中表達，而EmCTL-3 和EmCTL-4 則主要在精巢中表達。中華絨螯蟹（E.sinensis）的EsLecA 主要在精巢和胸神經節中表達，而EsLecG 則主要在胸神經節中表達[70]。

表1 甲殼類動物凝集素種類及蛋白分子大小

表1 （續）

表1 （續）

研究發現，甲殼類動物C型凝集素除作為PRRs 外，還同時在免疫反應中發揮多種免疫功能，例如凝集病原微生物（AMP）[100]、抗病毒應答[31，35，44]、粘附細胞[101]、增強調理、激活酚氧化酶原激活系統、形成結節、參與細胞吞噬作用和包封作用（encapsulation）[9]等。在凡納濱對蝦（L.vannamei）中發現的LvCTLD和在斑節對蝦（P.monodon）中提取的PmLT 可增強細胞包被反應，而LvCTLD 甚至可激活黑化作用[45，66]。在日本囊對蝦（M.japonicus）中分離出的MjCTL、凡納濱對蝦（L.vannamei）中的LvCTL1、斑節對蝦（P.monodon）中的PmAV，可以抑制病毒繁殖并引發細胞病變反應，同時還可參與抗病毒免疫，但研究發現其對白斑綜合征病毒（WSSV）不起作用[53，102]。在墨吉明對蝦（F.merguiensis）中分離的FmL 可增強抗菌活性[50]。馮錦玲等[23]在研究羅氏沼 蝦（M.rosenbergii）中發現，MrLec 可以結合脂多糖和肽聚糖，參與抗病毒和抗菌反應。凡納濱對蝦（L.vannamei）、南美藍對蝦（P.stylirostris）、遠洋梭子蟹（Portunus pelagicus）、中華絨螯蟹（E.sinensis）和擬穴青蟹（S.paramamosain）中的幾種C 型凝集素缺少信號肽，說明它們可能在胞內發揮作用[36，56，103]。在凡納濱對蝦（L.vannamei）中共分離出LvCTL1、LvCLT3、LvLec 共3 種C 型凝集素，其中LvCTL1 具有抗病毒功能[31]，而LvCTL3 可顯著降低感染副溶血弧菌和WSSV 引起的死亡率[104]，LvLec 則參與革蘭氏陰性菌的免疫應答[99]。中國明對蝦（F.chinensis）體內的FcLectin和Fc-hsL 具有2 個CRD[38-39]；FcLec3 可與WSSV的衣殼蛋白VP28 結合，且具有抑制細菌及真菌的作用[40]。斑節對蝦（P.monodon）中的PmAV 具有1 個典型的CRD，顯示出抗病毒活性，但不具備凝集活性[44]；FcLec4 作為調理素，可促進吞噬作用，清除弧菌[41]；Fc-hsL 對一些細菌和真菌具有直接滅殺功能[39]。在日本囊對蝦（M.japonicus）中獲得3個C型凝集素（MjLecA、MjLecB 和MjLecC），這些凝集素可以結合囊膜蛋白，阻止WSSV 對血細胞的感染，從而降低WSSV 感染率，其中兩種還可以體外降低感染效率[53]。在墨吉明對蝦（F.merguiensis）中克隆得到1 個雙CRD 凝集素FmLec，在受到WSSV 刺激后表達上調。在克氏原螯蝦中發現，PcLec-1、PcLec-2、PcLec-3凝集素，可促進蝦對鰻弧菌的清除，還可參與機體免疫反應，抵御細菌、病毒、寄生蟲等病原體感染[63，105]。

三疣梭子蟹（P.trituberculatus）中也克隆得到一種C 型凝集素[79]。閻德平等[80]在人工感染試驗中發現，CTL5 具有消除副溶血弧菌和WSSV 兩種病原的作用，且發揮一定的免疫應答功能。Qiu等[69]在體外試驗研究擬穴青蟹時發現，SpCTL6不能直接殺滅溶藻弧菌，但是能夠明顯降低溶藻弧菌內的毒素水平，從而減少因感染溶藻弧菌引起的死亡，提高蟹的成活率。

2.2 FBGLs 凝集素

FBGLs 是一類進化上非常保守的模式識別蛋白，主要包括纖維膠凝蛋白、tachylectins 和纖維蛋白原相關蛋白（fibrinogen-related proteins）。其主要參與非己識別和宿主免疫應答作用[106]。

在淡水螯蝦（又名信號克氏原螯蝦、淡水小龍蝦，P.leniusculus）中發現兩種膠原樣凝集素蛋白，它們不僅可以參與細菌結合還對革蘭氏陰性菌具有清除作用[86]。日本囊對蝦（M.japonicus）中發現的MjFREP1 對革蘭氏陽性菌具有凝集作用，同時能夠結合肽聚糖、脂多糖以及WSSV 的VP28 蛋白，在抗細菌和抗病毒反應中發揮重要作用[88]。羅氏沼蝦（M.rosenbergii）的兩種纖維膠凝蛋白以及Dai 等[90]在克氏原螯蝦體內鑒定的PcFLP1，均能夠凝集細菌，增強蝦體對細菌的清除能力，在抗弧菌免疫中發揮關鍵作用。

3 討論

在美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫中檢索到的中國明對蝦（F.chinensis）凝集素數據共43 條，其中有已發表論文支撐的只有10 條，其他數據均為軟件預測的功能結果，需要進一步開展試驗研究來挖掘其相關的功能。

在信號通路的研究中，針對甲殼類動物雖然也開展了一些工作，如中國明對蝦（F.chinensis）血細胞的酚氧化酶原系統包括脫顆粒和酚氧化酶（phenoloxidase，PO）的活性，是通過磷酸激酶C（phosphokinase C，PKC）通路來調節的[107]；羅氏沼蝦（M.rosenbergii）血細胞proPO 系統包括脫顆粒和PO 的活性，是ODN2006 通過PKC、TPK 信號通路來調節，且此過程與磷酸激酶A（phosphokinase A，PKA）信號通路無關[107]；凡納濱對蝦（L.vannamei）中LvCTL4 能通過激活NF-KB，隨信號通路參與抗菌免疫反應[108]，但是否同一物種同時存在著多條類似脊椎動物的信號途徑，如免疫缺陷同系物（IMD）途徑、JAK/STAT途徑、Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號途徑，仍缺乏系統性的研究數據來證明。從目前的報道來看，甲殼類動物信號途徑的整體性及調控機制還不明確，如在凡納濱對蝦（L.vannamei）中，已報道的9 種C 型凝集素如何發揮免疫學調控作用，9 種凝集素是否具有協同或抑制機制，這些都需要進一步開展相關試驗研究。

甲殼類動物凝集素的研究結果還需進一步整合，不同研究在同一物種分離到的凝集素是否是同一種物質，還需要進一步確認。如在羅氏沼蝦（M.rosenbergii）研究中，Snigdha 等[21]、Huang 等[22]發現的MrCTL，以及Feng 等[23]和Huang 等[24]發現的MrLec 具有不同的氨基酸數目和相對分子質量，其是同一種功能物質，還是兩種不同的物質，需要進一步比較確認。

4 結語

目前對甲殼類動物的免疫機制，主要以經濟品種對蝦、龍蝦、鰲蝦和蟹等動物為研究對象，取得了很多成果，在一定程度上揭示了甲殼類動物尤其是十足目動物免疫防御機制。然而受試驗材料及研究手段的限制，甲殼類動物的免疫機制研究仍然滯后于其他無脊椎動物，處于相對初級階段，對于病原體致病機制及蝦蟹先天性免疫防疫機制的研究仍然具有很大的提升空間。而對先天性免疫認識水平的提高，可以在促進蝦蟹自身的免疫能力方面，為疾病防治提供新的方法，從根本上提升防病治病水平。