豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5 擴增產物與其克隆后測序結果的比較

董友富，蔣廣志，唐偉明，王小泉，徐世富，高亞飛，孫 裴，張振東

（1.江蘇科技大學生物技術學院，江蘇鎮江 212018；2.安徽禾豐牧業有限公司，安徽利辛 236700；3.安徽農業大學動物科技學院，安徽合肥 230036）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一種呈球形、有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目（Nidovirales）動脈炎病毒科（Arteriviridae）豬動脈炎病毒屬（Porartevirus），分為兩個種——PRRSV1 和PRRSV2[1]。1996 年，我國分離到第一株PRRSV 毒株CH-1a。此后，PRRSV 在全國范圍內快速流行、變異與演化，大量毒株被分離到，主要為PRRSV2[2]。PRRSV 基因組全長約15.4 kb，主要包括NSP1α、NSP2 等16個非結構蛋白（nonstructural protein，NSP）以及GP2a、E、GP3、GP4、GP5、M、N 和GP5a 等結構蛋白，其中GP5 蛋白編碼基因常被用作PRRSV分子流行病學監測和遺傳演化分析的靶基因[3]。根據GP5 蛋白編碼基因序列，Shi 等[4]將PRRSV2劃分為9 個譜系（lineage），而我國PRRSV2 流行毒株主要為譜系1、3、5、8[5]。近年來，譜系1 NADC30-like 毒株的傳入，使得PRRSV 基因重組狀況愈加復雜，因而加劇了我國PRRSV 感染的防控難度[6]。

通過擴增PRRSV ORF5 片段，采用Sanger 基因測序進而了解PRRSV 毒株流行情況的方法，在臨床生產中被廣泛應用，在PRRSV 的分子流行病學調查研究、診斷鑒定（追溯系統的建立）及流行控制（后備豬的免疫馴化）等多個方面發揮了重要作用。眾所周知，PRRSV 作為一種RNA 病毒，在多種篩選壓力下，極易變異與重組，具有明顯的準種（quasispecies）現象[7-9]。臨床樣品中，PRRSV ORF5 片段的豐富度如何？通過RT-PCR 擴增產物直接測序能否準確反映樣品中的毒株情況？能否代表致病毒株？本試驗采用經典的“克隆+序列”的分析方法，對臨床樣品中PRRSV ORF5 片段的多樣性進行了分析，以期為我國PRRSV 感染的防控提供幫助。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品信息

2021年7—8月，江蘇省兩個規模化豬場（A、B）豬群表現出典型的PRRSV 感染癥狀，母豬流產比例明顯升高，保育豬被毛蓬亂、消瘦、咳喘，死淘率超過10%。在A、B 兩個豬場各采集1 頭典型發病保育豬的肺臟、脾臟、淋巴結等組織樣品，由江蘇科技大學生物技術學院實驗室保存備用。

1.2 RT-PCR 擴增、膠回收及連接轉化

將兩頭豬的組織樣品（A、B）分別研磨、離心，吸取240 μL 上清放于1.5 mL 的離心管中，按照杭州博日科技有限公司核酸提取試劑盒操作步驟進行RNA 提取。將提取的RNA 按照 HiScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進行反轉錄，合成cDNA；參照先前擴增體系與條件[3]，擴增PRRSV ORF5 片段。ORF5 RT-PCR 擴增產物一部分直接送至浙江尚亞生物技術有限公司進行序列測定，一部分膠回收后克隆至pMD19-T 載體，轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞，培養16～24 h 后，挑取單菌落進行培養，鑒定陽性菌液；選取15 個陽性菌落送至浙江尚亞生物技術有限公司進行序列測定。

1.3 同源性及遺傳演化分析

使用DNAstar 軟件中MegAligen，將獲得的ORF5 序列與常見參考毒株的ORF5 序列進行核苷酸同源性分析和氨基酸序列比對；使用MEGA7.0軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining），將獲得的ORF5 序列與國內外常見參考毒株進行進化樹繪制分析。PRRSV 參考毒株信息見表1。

表1 參考毒株信息

2 結果與分析

2.1 核苷酸及推導氨基酸同源性

對兩份組織樣品（A、B）研磨后抽提RNA，反轉錄后使用ORF5 全長序列擴增引物擴增出與目的片段大小一致的條帶。將A、B 樣品的兩個PCR 產物及其對應的15 個亞克隆陽性菌落分別測序，共獲得32 條ORF5 序列，將樣品A、B 通過PCR 產物直接測序獲得的ORF5 序列分別命名為A 和B 序列，通過亞克隆獲得的ORF5 序列命名為A/B-n（n代表陽性菌落編號）序列。對PCR 產物及其對應的亞克隆菌落獲得的序列進行比對分析。結果顯示，樣品A 獲得的16 條序列核苷酸同源性為84.2%～100%，其中7 條序列（A-8～10、A-12、A-17～19）同源性為100%，占比43.75%（7/16）；樣品B 獲得的16 條序列核苷酸同源性為87.4%～100%，序列完全一致的僅有5條（B、B-1、B-13、B-16、B-21），占比31.25%（5/16）。A 序列與其15 條亞克隆序列核苷酸同源性為87.7%～97.3%，其中與A-2、A-11 同源性較低，分別為87.7%、88.7%，與其他13 條序列同源性為97.2%～97.3%；B 序列與其15 條亞克隆序列核苷酸同源性為87.9%～100%，其中與B-11同源性最低，為87.9%，與B-8、B-18～20 同源性為87.9%～88.2%，與其他10 條序列同源性為99.5%～100%。

對樣品A、B 的PCR 產物及其對應的亞克隆序列推導氨基酸序列進行比對分析。結果顯示：樣品A 獲得的16 條序列推導氨基酸同源性為86.1%～100%，其中9 條序列（A-8～10、A-12、A-17～21）的推導氨基酸同源性為100%，占比56.25%（9/16）；樣品A 與其15 條亞克隆序列推導氨基酸同源性為88.5%～95.0%，其中與A-2、A-11 同源性較低，分別為88.6%、91.5%，與其他13 條序列同源性為94.5%～95.0%。樣品B 獲得的16 條序列推導氨基酸同源性為86.6%～100%，序列完全一致的有9 條（B、B-1、B-4、B-6、B-9、B-13、B-16、B-17、B-21），占56.25%（9/16），此外，B-19 與B-20 同源性也為100%；樣品B 與其15 條亞克隆序列推導氨基酸同源性為87.6%～100%，其中與B-8、B-11、B-18 同源性最低，均為87.6%，與B-19、B-20 同源性較低，均為88.6%，與其他10 條序列的同源性為99.0%～100%。

2.2 遺傳演化分析

將樣品A、B 測序獲得的序列與常見參考毒株的ORF5 序列進行比對并繪制遺傳進化樹。結果（圖1）顯示：樣品A 與A-1、A-4 等13 條序列與經典毒株VR2332 等位于同一分支，屬于譜系5，占87.50%（14/16）；A-2 與HP-PRRSV 毒株處于一個大的分支，屬于譜系8，占6.25%（1/16）；A-11 與NADC30-like 毒株親緣關系最近，屬于譜系1，占6.25%（1/16）。樣品B 與其亞克隆序列被劃分在了譜系5、8，占比分別為68.75%（11/16）、31.25%（5/16），其中B 與B-1 等10 條亞克隆序列屬于譜系5。

3 討論

20 世紀70 年代，準種的概念被提出并應用于病毒遺傳變異分析中，其是指受遺傳變異、競爭、宿主選擇及重組等一系列因素影響的，高度同源但不完全相同的變異株組成的動態群體[10-11]。作為一種RNA 病毒，在臨床生產中藥物、疫苗等多種篩選壓力下，PRRSV 極易變異與演化，已有研究[12-13]證實其在豬體內以準種形式存在。Zhang等[14]從同一個豬場不同年份內分離到了基因組差異明顯的毒株，進一步說明當出現具有更強適應性和增殖能力的PRRSV 毒株時，該毒種便會取代正在流行的毒株成為優勢毒株。本研究采用克隆結合測序的方式，對臨床樣品中的PRRSV ORF5片段多樣性進行了分析，樣品A 與B 中分別有87.50%、68.75%序列屬于譜系5，表明譜系5 毒株為PRRSV 優勢毒株，但各序列之間核苷酸同源性差異較大，介于84.2%～100%，表明豬只體內曾感染過不同毒株或使用過不同種類毒株的疫苗。樣品B 的PCR 產物直接測序序列與4 條亞克隆序列一致（占31.25%），與其他10 條序列劃分為同一譜系（占68.75%）；樣品A 的PCR 產物直接測序序列與亞克隆序列同源性最高的僅為95.0%，但與13 條序列屬于同一譜系（占87.50%），表明通過PCR 產物直接測序對了解場內流行毒株具有一定的指示意義，尤其在PCR 產物直接測序出現“較亂”峰圖（指出現亂峰、套峰）時。這也表明ORF5 豐富度高、準種復雜，建議采用多個亞克隆測序方式了解PRRSV 毒株情況。此外，近年來我國PRRSV 流行毒株基因復雜化程度加劇，不同譜系甚至多譜系的重組毒株越來越多，通過擴增單一片段無法真實反映動物體內數以萬計序列的全貌，更不能完全代表致病性毒株[15]。因此，為更好地了解臨床致病毒株的基因組序列，建議采用多片段（GP5、GP3、GP2、NSP2、NSP9 等）擴增測序分析方式，有條件時可以進行PRRSV 全基因組測序。