吳茱萸堿的藥理學研究進展

梁靖蓉，麥鳳怡，李陳廣，廖 翔，張治國

(1.深圳大學生物醫學工程學院，廣東 深圳 518060；2.華中科技大學協和深圳醫院疼痛科，廣東 深圳 518052；3.南方科技大學醫學院，廣東 深圳 518055)

吳茱萸俗稱吳萸、米辣子，具有較高的藥用價值，始載于《神農本草經》，列為中品。其味性辛熱，有小毒。《中國藥典》(2020年版)收載的吳茱萸來源蕓香科植物吳茱萸、石虎及蔬毛吳茱萸的干燥近成熟的果實，具有散寒止痛、降逆止嘔、寒疝腳氣、助陽止瀉及外治口舌生瘡和濕疹等功效。

傳承千年的中醫藥文化，底蘊豐富，集結了我國人民在長期的生產勞動、生活實踐與醫療實踐中的智慧。中藥往往是配伍用藥，藥對是中藥配伍的最小單位，遵循中藥配伍的“七情合和”理論；用藥中常常以相對固定的配伍形式進行使用，起到主次分明又相輔相成的作用。吳茱萸辛熱，黃連苦寒；前者能溫脾暖胃，后者黃連清熱燥濕、瀉火解毒，苦寒易傷脾胃。兩者常常配伍使用，一方面中和吳茱萸的熱性，另一方面中和黃連的苦寒之性。黃連和吳茱萸這一經典寒熱藥對，不同配伍，其功能主治各異，早在《丹溪心法·火六》中，以君藥黃連與佐藥吳茱萸6 ∶1的配伍比例組成左金丸(又稱回命丸)，主治肝火犯胃和消化性潰瘍。隨著黃連和吳茱萸配伍比例的變化還創造出運用于暑氣證、寒痢證和胃寒證的甘露散(2 ∶1)、茱萸丸(1 ∶1)和反左金丸(1 ∶6)等方劑。僅在配伍比例上略有變化，卻能產生完全不同的藥效作用，可見中藥配伍的神奇之處。

本草記載吳茱萸生品有小毒，且辛香走竄力量較強，因此，煎服多為炮制品。生吳茱萸溫熱苦燥，能祛寒燥濕，外用時可以經甘草制和水洗能降低毒性。黃連制能降逆止嘔，醋制能疏肝鎮痛，生姜制能散寒止嘔，鹽制能引藥入腎，酒制能治心腹氣滯作痛；說明古人對減輕毒性已經有宏觀的認識。另外，以吳茱萸入藥，還配制成了雪膽丸、華佗再造丸、戊己丸、四神丸、吳藿降壓滴丸和萸黃連飲片等常用中藥制劑。因此，進行中藥的相互作用研究，對發揮中藥協同增效作用、提高疾病治療效率、逆轉藥物多藥耐藥和降低毒副作用等具有重要意義，為更有效臨床用藥提供依據。

1 吳茱萸堿概述

通過成分分析屬蕓香科植物的吳茱萸的化學成分主要有：生物堿類、揮發油類、檸檬苦素類、萜類、香豆素等。其中生物堿類占主要部分，生物堿類主要又分吳茱萸堿和吳茱萸次堿等。《中國藥典》記載兩種堿類的總含量決定了吳茱萸藥材質量的優劣。

吳茱萸堿(evodiamine，EVO)是吳茱萸次堿(rutecarpine)的衍生物，也是一種色胺吲哚類生物堿，其相對分子質量為303.36，分子式為C19H17N3O，溶點278 ℃，其性狀為黃色片狀結晶。EVO結構比較不穩定，溫度超過60 ℃，pH<5或>9，即在過熱、酸、堿等情況下結構立即發生變化。如Fig 1所示，對比EVO和吳茱萸次堿的結構不難發現，兩者只有在14位置的N原子上一個甲基的差別。

Fig 1 Evodiamine and Rutecarpine chemical structural formula

其次，EVO屬生物藥劑學分類系統(Biopharmaceutics Classification System，BCS)中的二類藥物。并且是一種難溶性藥物，不溶于水、乙醚和丙酮，能溶于氯仿、醋酸，微溶于酒精。一般來說，溶出速率是制約其生物利用度的關鍵因素，而EVO生物利用度低，使用時也面臨這個難題。

近年來，嘗試將EVO制備成EVO羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)分子包合物或者采用微乳液遞送等[1]，不但提高了水溶性和溶解度，還提升了它的生物利用度。另外，炮制后吳茱萸的辛散之力和毒性都大大減低，內服需選用炮制的吳茱萸，藥典規定的最大用量為5 g。EVO具有抗炎、抗腫瘤、抗肥胖和抗心血管等多種藥理活性。隨著不斷延展到分子生物學、藥物化學和藥物代謝等領域內進行深入研究，EVO現代藥理作用的挖掘將會達到一個新的高度。

2 吳茱萸堿現代藥理學活性

2.1 抗炎活性近年來，吳茱萸堿的抗炎作用備受關注，在細胞和分子水平上，抑制眾多細胞相關的炎癥因子的分泌，主要有以下四個方面：①抑制巨噬細胞(macrophage，Mφ)炎癥因子的分泌：EVO通過抑制NF-κB及其介導的環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的活性，進一步抑制LPS誘導的RAW 264.7細胞前列腺素E2(PGE2)分泌，影響巨噬細胞的遷移[2]。②抑制單核細胞(monocyte，MO)炎癥因子的分泌：EVO可抑制淋巴毒素類似物(LIGHT)誘導的人MO分泌炎癥因子及眾多的CCR1、CCR2等趨化因子受體的表達以及人MO遷移[3]。③抑制中性粒細胞(neutrophile granulocyte，NE)中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生：EVO通過抑制小鼠中NE中還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性，進而減少ROS和超氧陰離子的產生[4]。④抑制小膠質細胞(microglial cells，MC)中促炎因子的產生：LPS處理小鼠BV2細胞后，結果顯示EVO可明顯抑制誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的合成，進而明顯抑制MC中促炎因子的生成[5]。

EVO可以在多種炎癥模型中發揮抗炎作用。例如，在酵母多糖(zymosan，ZYM)誘導的小鼠急性腹膜炎中，EVO能顯著改善模型小鼠體內的“炎癥風暴”，減少血清和腹腔中炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β和角化細胞來源趨化因子等)的分泌、減輕腹腔液NE的浸潤，并抑制NE中ROS的產生，此作用有可能是通過EVO抑制NF-κB的p65入核而起作用[6]。其次，發現EVO能減輕氣管滴注LPS誘導的急性肺損傷大鼠和小鼠模型肺水腫癥狀，同樣可以抑制肺組織細胞中NF-κB p65和p50的入核，從而減輕NE的浸潤、降低炎癥水平，發揮對急性肺損傷炎癥模型的保護作用[6]。此外，在灌胃干預之后，吳茱萸明顯改善動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)模型大鼠的血清膽固醇四項指標，能顯著降低主動脈弓和肝臟組織中炎癥性細胞的浸潤，且當EVO(25 mg/kg/day)灌胃時效果最為明顯[7]。同樣EVO灌胃后后可以明顯降低經典的小鼠潰瘍性結腸炎模型結腸組織中炎癥因子的水平。有趣的是，EVO還可以降低胞內的LPS含量以及重新平衡大腸桿菌和乳酸菌的數量。還有報道表明EVO不僅能減輕葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate，DSS)誘導的炎癥反應，且能維持腸道的完整性及腸道菌群的穩態，為臨床治療潰瘍性結腸炎提供了新的方向[8]。

2.2 抗腫瘤活性研究證實，EVO通過誘導腫瘤細胞凋亡、遏制腫瘤細胞周期和遷移而起到抗腫瘤作用。其中，誘導凋亡主要經內源性途徑、外源性途徑及內質網途徑實現，在這些途徑中常常涉及眾多重要的信號通路(NF-κB、mT0R/S6Kl、JNK等)[9]。目前有研究報道EVO對多種腫瘤細胞有積極的抗腫瘤作用，例如黑色素瘤A375、人胰腺癌細胞PANC-1、人宮頸癌細胞Hela、乳腺癌細胞MCF-7、胃癌細胞SGC-7901等。另外EVO除了自身的抗癌作用，在聯合紫杉醇或黃連素等也能發揮較好的協同增益功能，降低化療藥物的使用量，進而減低對正常細胞的毒副作用，將為臨床提供更好的治療方案。

2.3 抗肥胖活性脂肪細胞的分化是研究肥胖癥和糖尿病的關鍵點。Wang等[10]觀察使用EVO處理脂肪細胞發現EVO可以抑制脂肪細胞分化的功能，其機制與EGFR-pKCa-ERK信號通路的激活密切相關；Kobayashi等[11]證實EVO發揮抗肥胖活性可能是通過增加棕色脂肪組織中β3腎上腺素的分泌來增強解偶聯蛋白1(UCP-1)的產熱作用；另有研究報道，黃連與吳茱萸(1 ∶1)的配伍，也能改善高脂血癥模型大鼠血清四項指標的水平，同時激活JAK2/STAT3通路，調節脂質代謝，這也可能是黃連與吳茱萸的配伍后治療高血脂癥大鼠的機制之一[12]；Shi等[13]在研究實驗中發現，經過灌胃給藥之后，EVO可以達到抑制肥胖的作用，機制可能是其抑制下丘腦弓狀核內促食欲肽NPY的表達，這個機制值得進一步深入研究。

2.4 阿爾茨海默病阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，由于大腦內β-淀粉樣蛋白(amyloid β protein，Aβ)的產生和降解機制失衡而對大腦神經元造成極大性破壞，神經元內的神經纖維、皮層動脈和小動脈發生改變，引起大腦神經元數量減少，出現記憶學習功能障礙。通過微量注射器ICV(側腦室)注射Aβ蛋白，誘導AD小鼠模型，EVO灌胃21 d后，發現灌胃EVO組較AD組能明顯抑制小鼠海馬體細胞的凋亡，且這種抑制作用有可能通過降低p53的表達和其磷酸化的水平實現的。研究發現，雖然EVO對Aβ的沉積無明顯作用，但是它可以明顯降低AD模型小鼠腦中炎性細胞因子的表達以及增加其腦部組織對葡萄糖的攝取而明顯地改善AD的癥狀，說明EVO通過抗炎作用發揮抗老年癡呆的作用[14]。另外，通過Morris水迷宮實驗中，發現EVO組能明顯減少平均潛伏期，能顯著改善AD小鼠的空間認知和學習能力，減少了測試中的逃避潛伏時間，保護腦組織[15]。這些研究說明EVO可能成為治療及預防AD的候選天然藥物。

2.5 抗菌活性吳茱萸提取物的體外抗菌實驗中，發現對常見的幽門螺旋桿、菌金黃色葡萄球菌等有明顯的抑制作用。然而，很多中藥的成分在體外表現較為顯著的抗菌抑菌作用，但是在進入體內后由于諸多因素的影響下效果卻不佳，甚至作用消失。抗菌實驗中，檢測中藥給藥后的含藥血清能準確反映中藥的抗菌功效。Wu等[16]預先對家兔進行灌胃，連續給藥3 d，3次/天，然后收集血清，發現收集的血清中EVO的含量最高；進一步用含EVO的血清處理各種細菌(傷寒桿菌、福氏志賀菌等)，結果顯示都有較好的抑菌作用，但是對于EVO的抗菌抑菌機制仍需進一步探索。

3 吳茱萸堿與蛋白之間的作用

EVO分子靶點的確定為實現對其藥理的深入研究提供了絕佳的時機。到目前為止，TRPV1和拓撲異構酶作用靶點的發現是EVO藥理學的研究的階段性成果。這兩個藥物作用靶點在炎癥和癌癥等發生發展過程中具有不可忽視的重要地位。眾多研究致力于闡明EVO與其靶點相互作用的復合物結構，這些復合物結構將是研究多靶點藥物的前提，注定是研究的焦點。

3.1 TRPV1眾多周知，瞬時感受器電位香草酸受體l(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)作為一種非選擇性的配體門控的陽離子通道蛋白激活后主要引起細胞外的Ca2+向細胞內的流動。正因為TRPV1在炎癥進程中有著舉足輕重的作用，EVO通過激活TRPV1受體才能達到抑制炎癥反應的作用[17]。其機制是通過抑制IL-4誘導的M2型巨噬細胞分泌產生的細胞因子TGF-β而抑制炎癥。同樣報道過吳茱萸和其提取物具有抗肥胖的作用，機制與辣椒素相似，通過不斷消耗熱量而降低脂肪的堆積。在結構水平上，通過分子對接，計算機模擬分析發現EVO的環1與TRPV1活性位點Tyr511發生疏水作用，環5與Tyr555形成π-π鍵相互作用。因此，EVO可以作為骨架結構研發作用于TRPV1新的藥物或者配體[17]。

3.2 DNA拓撲異構酶研究發現，EVO可以抑制大腸桿菌中被拓撲異構酶I(topoisomerase I，TOPI)催化的超螺旋質粒DNA的松弛達到抗菌的作用，可以與TOPI的Arg161和Asp551殘基相互作用[18]。另外，發現EVO對多藥耐藥的肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)具有明顯的殺菌作用[18]。EVO可能作為抗耐藥菌的天然藥物值得深入研究。有報道發現由于EVO可以抑制TOPI，與DNA形成共價復合物，并且與依立替康(Irinotecan)相似，能誘導DNA的損傷，但TOPI抑制劑Irinotecan等會抑制在S期。而在研究人前列腺癌、小鼠結腸癌的過程中發現，EVO處理后將細胞周期阻滯在G2/M期，這與以往的TOPI抑制劑的作用有所差別，因此有研究進一步發現EVO可以影響人乳腺癌細胞的微管解聚與聚合之間的平衡，抑制人乳腺癌細胞的增值，其中分子機制的發現豐富了EVO的抗癌機制。另外，根據EVO在TOPI結合口袋中的結合模式，采用苯甲酰基團替代EVO的吲哚氮原子，能夠表現出更好的抗腫瘤活性。

3.3 微管蛋白研究證實，過表達的去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)顯著增加患者發生腫瘤的風險[19]。因此，HDACs是一個潛在的腫瘤治療靶點。而EVO可抑制HDAC6的活性，激活MAPK信號通路，活化caspase-3，誘導人白血病細胞K562周期阻滯和凋亡[20]。同時，EVO可以明顯抑制Burkitt淋巴瘤細胞系Raji和T淋巴系白血病細胞株Jurkat的增殖，可能為臨床治療淋巴瘤和白血病帶來了新的希望[21]。

此外，EVO能夠通過抑制HDAC6的活性參與微管的乙酰化調節過程。研究發現EVO濃度為4 μmol·L-1時可以促進體外微管蛋白的聚合，發現了EVO具有紫杉醇樣活性[22]，同時應用計算機析分析出EVO在β-tubulin蛋白內紫杉醇結合位點有較大的對接活性，并推測出EVO與β-tubulin蛋白的Thr276形成氫鍵，與Leu371和Ala233形成范德華力相互作用而到達與微管蛋白相互穩定結合的效應。提示了β-tubulin可能是EVO的作用靶點，且可能與紫杉醇有競爭結合的作用[23]。這些結果都表明，由于EVO參與微管的調節過程，可能作為新的微管抑制劑用于抗腫瘤治療的探索。

另外，Liao等[22]和Huang等[24]的兩個實驗室都提到了EVO對微管蛋白的潛在活性，但是實驗結果卻恰恰相反。首先，兩者都進行了通過invivo微管聚合實驗，Liao發現在體內EVO可以增加聚合型微管蛋白，然而Huang的實驗結果卻相反，因此，EVO對微管蛋白的潛在活性需要進一步論證。除了β-tubulin外，EVO處理肝癌細胞HepG-2后，通過共聚焦發現微管蛋白α-tubulin分布形態紊亂，由長條型變為不規則型或圓型；EVO濃度越高時，α-tubulin的排列方式改變就越顯著。通過向細胞的一側聚合，從原先的輻射狀變換成束狀分布，顏色呈亮綠色。表明EVO阻遏腫瘤細胞周期和增殖可能與改變細胞微管蛋白的聚合態密切相關。細胞骨架微管通過調控NLRP3炎癥小體成分(ASC和NLRP3)的空間重排和轉運，在調節NLRP3炎癥小體活化過程中起著關鍵作用[25]。而Li等[23]研究發現EVO能夠明顯增強巨噬細胞中α-tubulin(K40)的乙酰化水平，且誘導線粒體的運輸，最后乙酰化微管束緊靠微管組織中心(microtubule organizing centers，MTOCs)，說明EVO通過誘導α-tubulin乙酰化，有利于線粒體上的ASC朝向MTOCs的運輸，小鼠體內發生NLRP3炎癥小體活化而發生細胞焦亡。而通過α-tubulin乙酰化的抑制劑白藜蘆醇和NAD+或者siRNA敲低αTAT1(α-tubulin乙酰化關鍵酶)的表達，能夠明顯逆轉EVO促進ATP或nigericin誘導的NLRP3炎癥小體活化和細胞焦亡。因此，這些研究結果提示對微管蛋白的乙酰化修飾也是EVO的一個新的及重要的藥理學活性。

3.4 mTOR蛋白哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路參與調節細胞增殖、分化、遷移，在卵巢癌、非小細胞肺癌、胃癌、結腸癌等腫瘤中高度活化。體內外實驗表明，EVO可明顯增加細胞內自噬體及ROS的產生，上調細胞內LC3、同時抑制p62等蛋白的表達，同時能上調AMPK/mTOR信號通路關鍵蛋白的表達，激活自噬，抑制結腸癌HCT-116細胞增殖[26]。研究發現EVO可以作用mTOR信號通路，抑制mTOR的磷酸化，促進胃癌SGC-7901細胞凋亡[27]。

3.5 毒性及安全性用藥藥典記載吳茱萸有小毒，EVO也具有潛在的毒性作用。例如，肝毒性、腎毒性、心臟毒性等。在研究EVO藥理學活性和蛋白互作靶點時，也應更加重視對吳茱萸毒性的研究。例如，Cai等[28]研究發現EVO具有肝毒性可能與誘導線粒體腫脹、空泡化、MPT孔開放和線粒體電位顯著降低，導致ATP耗竭和CytC釋放，最終觸發細胞死亡信號有關。Wu等[29]研究顯示EVO-7和EVO-8，但不是EVO-1或EVO-6，可以誘導人腎細胞癌A498細胞中Bcl-2蛋白的聚合酶(PARP)切割和磷酸化，促進A498的凋亡。可見，EVO對腫瘤細胞具有毒性作用，也可以用于腫瘤的干預治療。EVO對心血管疾病的治療，但是也可能促進氧化應激介導心血管的損壞，在運用中注意監測其用量和劑型的使用。

4 結語

綜上，大量研究證實了EVO的抑瘤活性，可見抗腫瘤作用將是EVO發揮的主要藥理作用之一，其抗腫瘤特性比較廣泛，值得基礎研究和臨床試驗進一步挖掘，它可能作為一種天然抗癌新藥為患者的抗腫瘤治療帶來新的希望。最近研究發現使用誘導細胞凋亡的化療藥物處理后，能激活caspase-3進而切割GSDME的267-270位點產生GSDME-NT片段，并在膜上形成孔洞，誘導細胞二次壞死[30]。因此，探索EVO是否能影響GSDME的相關機制，將有待發現EVO又一新的抗癌機制。

EVO的毒性和用藥安全也是在關注其藥理學活性的同時更加關注的。一方面在臨床合理用藥中，減少不良反應，減少對患者的健康的危害；另一方面也要通過對其毒理機制的深入認識，擴展EVO在臨床上應用范圍，特別是EVO衍生物的開發和應用。

中醫常將吳茱萸用于治療喉舌口瘡、癰疽發背和腳氣等感染相關炎癥性疾病，但其藥理機制未明。對于這些慢性遷延性感染(如瘡癰、腳氣等)或其他慢性疾病(如肥胖等)而言，已活化的巨噬細胞會不斷釋放炎癥因子，導致反復的慢性炎癥性癥狀的發生，促使其快速焦亡可能是最好的策略，然而至今也沒有找到明確的、可逆轉已活化巨噬細胞的辦法。因此，吳茱萸中的有效成分EVO可以促進NLRP3炎癥小體活化，將可用于各種現代意義上的感染相關炎癥性疾病(如消化性潰瘍、痢疾等)的臨床治療，而在未來的研究中可能將中醫術語與現代醫學術語一一對應。