CircRNA-32011調(diào)控三氧化二砷誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡

馬文俊，尚愛晶，常 琳，程文政，吳繼臣，官曉翔，張 榮，姜 媛，劉嘉祺，付 惠，王 瑩，許超千

(1．牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，北方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究合作中心，黑龍江 哈爾濱 150086)

三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是砷的無機化合物，同時作為中藥砒霜的有效成分，也是治療急性早幼粒細胞白血病(APL)最有效藥物之一，并且ATO在我國已經(jīng)作為臨床治療APL的首選藥物之一[1]。研究顯示[2]，ATO在治療急性早幼粒細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、膠質(zhì)母細胞瘤及其他惡性腫瘤方面均取得良好的效果。但是，有臨床數(shù)據(jù)表明長期暴露于治療劑量的ATO會誘發(fā)嚴重的不良反應(yīng)，例如心臟毒性、消化道癥狀以及腎損害，其中嚴重的心臟毒性阻礙了ATO在臨床的廣泛應(yīng)用，因此我們有必要針對ATO引起心臟毒性的機制進行深入探索。

環(huán)狀RNAs(circRNAs)與傳統(tǒng)的線性RNA不同，其不具有5′末端帽子和3′末端polyA尾巴，通常由蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子、內(nèi)含子、外顯子-內(nèi)含子和tRNA內(nèi)含子區(qū)域通過RNA 3′端和5′端的外顯子或內(nèi)含子環(huán)化產(chǎn)生。CircRNAs分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達更穩(wěn)定，不易降解[3]。近年來[4]，多項研究表明，circRNAs可參與調(diào)控心肌細胞凋亡。例如，Cui等[5]發(fā)現(xiàn)采用過氧化氫刺激H9C2細胞，circNFIX的表達明顯下調(diào)。過表達circNFIX可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡。CircSAMD4A抑制miR-138-5p的表達，促進缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細胞凋亡和炎癥反應(yīng)[6]。沉默Circ-0062389可通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3信號通路緩解大鼠心力衰竭中心肌細胞凋亡[7]。

本研究首先驗證ATO誘導(dǎo)心肌細胞凋亡并通過基因芯片篩選出差異表達的circRNA-32011；進一步探究circRNA-32011在ATO誘導(dǎo)心肌細胞凋亡中的作用，為預(yù)防和治療ATO引起的心臟損傷提供理論依據(jù)和治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑本實驗采用的ICR乳鼠(1～3 d)由牡丹江醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供；DMEM培養(yǎng)基(01-052-1ACS)、特級胎牛血清(04-001-1A)和DPBS(02-023-1ACS)購自以色列Bioind公司；LipofectamineTM2000試劑盒(11668-019)購自Thermo Fisher Sci-entific；qPCR RT Kit(FSQ-101)、SYBR Green PCR Master Mix(QPK-201)購自上海東洋紡生物科技有限公司；Ⅱ型膠原酶(17101-015)購自美國Gibco公司；Anti-β-actin(20536-1-AP)、Anti-BAX(50599-2-Ig)、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(SA00001-2-100 μL)購自中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Anti-Bcl-2(A19693)購自中國Abclonal公司；CircRNA-32011質(zhì)粒購自上海吉凱基因股份有限公司；Si-CircRNA-32011購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 儀器熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；AI600掃描成像系統(tǒng)購自美國GE公司；酶標儀購自美國MD SpectraMax公司。

1.3 原代心肌細胞培養(yǎng)取1～3 d的新生乳鼠(25～30只)開胸摘取心臟，置于預(yù)冷的已加入雙抗的PBS中，巴氏吸管將心臟和液體吸入15 mL離心管，棄掉液體后加入D′hanks液沖洗，加入3 mL D′hanks液和2 mL低溫胰酶，放于4 ℃搖床8～12 h。配置Ⅱ型膠原酶。8～12 h后棄掉液體，加入7 mL配好的Ⅱ型膠原酶，37 ℃搖床恒溫搖10 min后吸取上清，整個過程重復(fù)3次。將離心管中上清液離心，1 000 r·min-1,5 min，棄上清，沉淀加入完全培養(yǎng)基，輕吹打加入培養(yǎng)瓶。1.5 h后收集完全培養(yǎng)基到6孔板，6孔板中即原代心肌細胞。細胞在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃的含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到70%～80%后棄上清液，進行后續(xù)轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染24 h后進行相關(guān)實驗。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染與分組用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染CircRNA-32011及其陰性對照。針對CircRNA-32011設(shè)計并合成si-RNA及其陰性對照。構(gòu)建CircRNA-32011的過表達載體。將乳鼠原代心肌細胞按實驗要求，轉(zhuǎn)染siRNA則為以下各組：(1)Control組：正常對照組；(2)siRNA組；(3)NC組。轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒則為以下各組：(1)Control組：正常對照組；(2)過表達質(zhì)粒組；(3)Vector組。

1.5 MTT將心肌細胞接種在96孔培養(yǎng)板中，并在37 ℃下用5%CO2孵育。處理后，進行MTT測定，向每個孔中加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)并孵育4 h。然后將Formazan晶體溶解在200 μL DMSO中。用酶標儀在490 nm處測量吸光度值。

1.6 RT-PCR用TRIzol試劑提取細胞中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR采用實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行。用2-△△Ct法計算基因的相對表達水平。具體操作方法參照文獻進行，以β-actin作為內(nèi)參，引物序列如下。

1.7 Western blot取“1.4”中分組的心肌細胞，棄培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，吸干殘留液體每孔加100 μL 1× RIPA裂解液，用細胞刮刀將細胞刮落并收集，冰上繼續(xù)裂解20 min，12 000×g，4 ℃離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新1.5 mL EP管內(nèi)，BCA法測蛋白濃度，然后將蛋白樣品與6×上樣緩沖液混勻后，100 ℃變性10 min，進行 SDS-PAGE 蛋白電泳，在冰浴條件下300 mA，1 h轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用PBST洗膜3次，快速封閉液封閉10 min，用1 ∶1 000比例配制的一抗在4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，用1 ∶10 000比例配制的二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，使用ImageJ軟件進行半定量分析，以目標蛋白條帶的吸光度值與內(nèi)參蛋白條帶吸光度值比值表示Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平，Bax與Bcl-2吸光度比值表示細胞凋亡水平。

Tab 1 RT-PCR primer sequences

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析所有實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)以及t-檢驗(t-test)對所得數(shù)據(jù)進行分析。使用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并制作圖表。

2 結(jié)果

2.1 三氧化二砷促進心肌細胞凋亡采用不同濃度的ATO(1、5、10、15 μmol·L-1)處理乳鼠原代心肌細胞24 h，通過MTT檢測心肌細胞活力，結(jié)果顯示ATO終濃度為10 μmol·L-1時心肌細胞活力明顯下降(P<0.01)(Fig 1A)。此外，通過Western blot和RT-PCR分別檢測細胞凋亡相關(guān)指標Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白水平變化，結(jié)果顯示,與control組相比，ATO組Bcl-2/Bax mRNA(Fig 1B)和蛋白(Fig 1C)明顯降低(P<0.01)。以上結(jié)果表明ATO促進心肌細胞凋亡。

2.2 CircRNA-32011在ATO作用的心肌細胞中表達下調(diào)為探究circRNAs在ATO誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡中的調(diào)控作用，我們從缺血心肌組織circRNAs差異表達芯片結(jié)果中篩選出3條低表達(具有潛在心臟保護功能)的circRNAs(CircRNA-41355、CircRNA-31781以及CircRNA-32011)，通過RT-PCR檢測ATO處理的心肌細胞中這3條circRNAs表達變化，結(jié)果顯示，與control組相比，ATO組circRNA-32011表達明顯下調(diào)(P<0.01)(Fig 2A)，因此，選

Fig 1 Myocardial cell apoptosis promoted by arsenic trioxide A:Cell viability of cardiomyocytes detected by MTT assay,.B:MRNA levels of Bcl-2/Bax detected by RT-PCR,scale:10 μmol·L-1.C.Protein levels of Bcl-2/Bax measured by Western blot,scale:10 μmol·L-1,*P<0.05,**P<0.01 vs control.

Fig 2 CircRNA-32011 down-regulated in ATO-induced myocardial apoptosis A:MRNA levels of circRNAs detected by n=5 ),**P<0.01 vs control.B:CircRNA-32011 cyclization sites verified by Sanger sequencing.C:The stability of CircRNA-32011 verified by agarose gel electrophoresis after RNaseR treatment.

擇circRNA-32011作為后續(xù)研究對象。通過Sanger測序證實circRNA-32011存在反向剪切位點(Fig 2B)；核酸外切酶R(RNaseR)實驗結(jié)果顯示，與線性親本基因相比，circRNA-32011能夠抵抗RNaseR的消化，表明circRNA-32011具有穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Fig 2C)。

2.3 過表達circRNA-32011抑制ATO誘導(dǎo)心肌細胞凋亡作用為探究circRNA-32011對ATO誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的影響，我們構(gòu)建了circRNA-32011過表達質(zhì)粒。首先將circRNA-32011過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至正常乳鼠原代心肌細胞。RT-PCR檢測顯示相比于對照組circRNA-32011上調(diào)了17.63±0.1倍(P<0.05)(Fig 3A)。利用MTT、RT-PCR及Western blot分別檢測心肌細胞活力和凋亡相關(guān)基因(Bax和Bcl-2)的mRNA和蛋白表達情況，結(jié)果顯示，生理條件下，與vector組相比，過表達circRNA-32011后，心肌細胞活力和Bcl-2/Bax均無明顯變化(Fig 3B-D)，提示circRNA-32011在生理條件下對心肌細胞無損傷作用。接下來，我們過表達circRNA-32011后予以ATO干預(yù)。通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)與control組進行相比，ATO組能夠明顯降低心肌細胞活力，而過表達circRNA-32011逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(P<0.01)(Fig 3E)。RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，與ATO組相比，過表達circRNA-32011明顯抑制ATO誘導(dǎo)的Bcl-2/Bax下調(diào)(P<0.01)(Fig 3F-G)。以上結(jié)果表明，過表達circRNA-32011可抑制ATO誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

Fig 3 ATO-induced apoptosis in cardiomyocytes inhibited by overexpression of n=5 )A:MRNA levels of circRNAs dected by RT-PCR,**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs vector.B:Cell viability after transfection with circRNA-32011 plasmid.C:MRNA levels of Bcl-2/Bax detected by RT-PCR.D:Protein levels of Bcl-2/Bax measured by Western blot.E:Cell viability detected by MTT assay,**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs vector.F:MRNA levels of Bcl-2/Bax detected by RT-PCR;*P<0.05,**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs ATO+vector.G:Protein levels of Bcl-2/Bax measured by Western blot,**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs ATO+vector.

2.4 敲減circRNA-32011促進ATO誘導(dǎo)心肌細胞凋亡作用為進一步明確circRNA-32011對ATO誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的影響，采用特異性siRNA沉默內(nèi)源性circRNA-32011。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與control組相比，si-circRNA組circRNA-32011表達水平下調(diào)至約42%，有效抑制其表達(P<0.01)(Fig 4A)。首先在生理條件下，向乳鼠原代心肌細胞中轉(zhuǎn)染circRNA-32011的siRNA。通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)與NC組進行相比，敲減circRNA-32011心肌細胞活力下降(Fig 4B)。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，正常水平下敲減circRNA-32011心肌細胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax表達降低(P<0.05)(Fig 4C-D)。為進一步探究circRNA-32011功能，我們轉(zhuǎn)染si-circRNA后予以ATO進行干預(yù)。MTT實驗結(jié)果表明，與(ATO+NC)組，敲減circRNA-32011進一步加重ATO降低心肌細胞活力(P<0.01)(Fig 4E)。Western blot結(jié)果表明，與(ATO+NC)組相比，敲減circRNA-32011進一步降低Bcl-2/Bax表達水平(P<0.01)(Fig 4F)。以上結(jié)果表明，敲減circRNA-32011加重ATO誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

3 討論

應(yīng)用ATO可對身體各個器官造成不同程度的損害，其中心臟毒性最為明顯[8]。目前ATO產(chǎn)生心臟毒性的機制仍不明確，已有研究顯示，ATO可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡、阻斷心肌細胞分化、誘導(dǎo)心肌細胞生長停滯以及延長心臟Q-T間隔[9]。

ATO可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，而金雀異黃素可抑制細胞內(nèi)鈣超載，下調(diào)p-JNK和p-p38-MAPK蛋白表達改善線粒體膜電位的損傷，從而抑制caspase-3活性，抑制ATO誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，發(fā)揮心臟保

Fig 4 ATO-induced apoptosis in cardiomyocytes promoted by knockdown circRNA-32011 )A:MRNA levels of circRNAs detected by RT-PCR,**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs NC.B:Cell viability detected by MTT assay,**P<0.01 vs control;#P<0.05 vs NC.C:MRNA levels of Bcl-2/Bax detected by RT-PCR,*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs NC.D:Protein levels of Bcl-2/Bax measured by Western blot,*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs NC.E:Cell viability detected by MTT assay,**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs ATO+NC.F:Protein levels of Bcl-2/Bax measured by Western blot,**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs ATO+NC.

護作用，該研究提示ATO誘導(dǎo)心肌細胞凋亡過程可調(diào)控[10]。Bao等[11]研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用0.1、0.5和1 μmol·L-1ATO可抑制人誘導(dǎo)多能干細胞 (hiPSCs)增殖，抑制心臟分化過程，在該研究中,TUNEL實驗結(jié)果顯示，在心臟分化過程中，ATO可引起細胞凋亡，且呈濃度依賴性。此外，ATO可引起DNA損傷，表現(xiàn)為γH2AX的上調(diào)，γH2AX是DNA雙鏈斷裂標記。與以上研究相符，本課題結(jié)果顯示,ATO抑制心肌細胞活力，凋亡相關(guān)指標Bcl-2/Bax表達，提示ATO誘導(dǎo)心肌細胞凋亡。為改善ATO心臟毒性，擴展ATO臨床應(yīng)用，本研究進一步探究三氧化二砷誘導(dǎo)心肌細胞凋亡機制。

研究表明circRNAs參與調(diào)控多種疾病發(fā)生發(fā)展，包括心血管疾病[12]。多項研究顯示,circRNAs可調(diào)控心肌細胞凋亡[10-11]，因此，探究circRNAs是否參與調(diào)控ATO誘導(dǎo)的心肌凋亡，對診斷和治療 ATO造成的心肌損傷具有重要意義。本研究首先從缺血心肌組織circRNAs差異表達芯片，篩選3條差異低表達(具有潛在心臟保護功能)的circRNAs，通過RT-PCR實驗檢測ATO處理的心肌細胞中3條circRNAs的表達變化，其中circRNA-32011明顯下調(diào)，提示其可能參與調(diào)控ATO誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡過程。由于circRNAs通過外顯子或內(nèi)含子環(huán)化作用在3′和5′末端連接形成完整的環(huán)結(jié)構(gòu)，因此它們不易被核酸外切酶降解，比線性RNA更穩(wěn)定[13]。本研究中Sanger測序及核酸外切酶R實驗結(jié)果顯示circRNA-32011具環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

本研究構(gòu)建circRNA-32011過表達質(zhì)粒，生理條件下，心肌細胞中轉(zhuǎn)染circRNA-32011過表達質(zhì)粒，PCR結(jié)果顯示與對照組相比，轉(zhuǎn)染組circRNA-32011表達升高。提示在心肌細胞中成功過表達circRNA-32011。隨后，ATO加藥組心肌細胞中轉(zhuǎn)染circRNA-32011過表達質(zhì)粒，結(jié)果顯示過表達circRNA-32011明顯抑制ATO誘導(dǎo)的心肌細胞存活率及Bcl-2/Bax下調(diào)，表明circRNA-32011可抑制ATO誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。本研究采用特異性siRNA敲減內(nèi)源性circRNA-32011，在轉(zhuǎn)染si-circRNA后給予ATO進行干預(yù)，結(jié)果顯示，與ATO組相比，敲減circRNA-32011進一步降低細胞存活率及Bcl-2/Bax，表明敲減circRNA-32011加重ATO誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，circRNA-32011參與調(diào)控ATO誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，但具體下游調(diào)控機制還有待進一步的研究。CircRNAs發(fā)揮功能的主要作用機制是作為miRNA分子海綿，通過ceRNA機制調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和翻譯，例如circNCX1靶向結(jié)合miR-133a-3p促進心肌細胞凋亡[14]。此外，研究表明circRNAs可與蛋白直接結(jié)合，在癌癥干細胞(CSC)中circZKSCAN1通過競爭性結(jié)合FMRP(一種RNA結(jié)合蛋白)抑制FMRP與β-catenin結(jié)合蛋白和凋亡調(diào)節(jié)蛋白1(CCAR1)mRNA結(jié)合，進而抑制Wnt信號通路[15]。

本研究僅在乳鼠原代心肌細胞離體水平驗證circRNA-32011可參與調(diào)控ATO誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。后續(xù)實驗需通過動物在體進一步驗證circRNA-32011功能。同時，利用生物信息學(xué)預(yù)測circRNA-32011調(diào)控心肌細胞凋亡的下游靶點，明確circRNA-32011調(diào)控ATO誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的具體機制。

綜上所述，本研究明確了circRNA-32011調(diào)控ATO誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的作用。ATO處理的心肌細胞中circRNA-32011異常低表達，過表達circRNA-32011逆轉(zhuǎn)由ATO誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，發(fā)揮心肌細胞保護功能。提示circRNA-32011可能成為預(yù)防和治療ATO心臟毒性的新型指標和藥物，為擴展ATO臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，具有重要的臨床治療意義。