青藤堿對有機錫損傷肝HL02細胞的保護作用及其機制

段治宇，王效蕊，梁婷婷，李青山，3，梁泰剛

(1.山西醫科大學藥學院，山西 晉中 030600；2.山西省中醫院，山西 太原 030012；3.山西中醫藥大學，山西 晉中 030619)

近幾十年來，有機錫化合物在工農業生產中被廣泛應用，如船體防污漆及木材防腐劑等。在使用過程中，該類化合物會不可避免地向環境中排放[1]。然而，大多數有機錫化合物具有高生物毒性，這些化合物可通過小腸或皮膚等途徑進入人體。特別是三取代體最易被吸收，并主要分布在肝、腎和腦部[2]。其中，作為三丁基氯化錫在人體內的主要的降解產物，二氯二丁基錫對人體產生的危害同樣引起人們的重視。

肝臟作為人體的主要代謝部位，在分子解毒的過程中可能會生成過量的有毒活性氧。這會對肝細胞造成氧化損傷，嚴重時會損害這一關鍵器官的功能[3]。而抗氧化劑的使用可保護肝臟免受自由基介導的損傷。有研究發現，一些具有抗氧化作用的天然活性產物對肝損傷的治療具有顯著效果[4 - 5]。

青藤堿(sinomenine，SIN)是從防己科植物青藤的干燥藤莖中提取的生物堿，具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[6]。此外，SIN具有抗氧化作用[7]。本課題組前期研究證實了SIN可以保護H2O2導致的肝HL02細胞損傷。

本研究通過建立二氯二丁基錫誘導的HL02細胞損傷模型觀察SIN對細胞的保護作用及對凋亡相關信號通路的影響，旨在進一步闡明SIN發揮保護作用的機制，為深入探討其潛在藥用價值研究提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 儀器光學倒置顯微鏡(OPTECBDS200-PH，重慶Optec Instrument公司)；酶標儀(Thermo Scientific)；臺式低速離心機(TD5A-WS，長沙湘儀有限公司)；高速冷凍離心機(TGL-16gR，上海安亭科學儀器廠)；熒光倒置顯微鏡(IX-51，Olympus)；流式細胞儀(BD-C6，USA)；實時定量PCR儀(Step One，Applied Biosystems)。

1.2 細胞株HL02細胞株來自中國科學院細胞庫。

1.3 主要試劑二氯二丁基錫(貨號205494)購自美國Sigma公司；青藤堿(純度>97%，貨號S302249)購自上海aladdin公司；吖啶橙(AO，貨號0360-50G)、溴化乙錠(EB，貨號0492-5G)均購自美國Amerisco公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒(貨號C1300-1-2)購自北京ApplyGEN公司；雙染凋亡檢測試劑盒(貨號KGA106)購自江蘇keyGEN BioTECH公司；RNA提取試劑盒(貨號9753Q)購自北京Takara Bio公司；兔抗cleaved caspase-3(貨號9664)、caspase-9抗體(貨號9502)均購自美國Cell Signaling公司。RPMI 1640培養基(貨號31870082)、胎牛血清(FBS，貨號10100147)、青鏈霉素雙抗混合液(貨號15070063)購自美國Invitrogen Life公司；引物合成自生工生物工程有限公司。

1.4 細胞培養將HL02細胞接種于無菌培養瓶中，加入含10% FBS的RPMI 1640培養液，將其置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。

1.5 方法

1.5.1 MTT法測定細胞活力

1.5.1.1 SIN毒性實驗 取對數生長期的HL02細胞，均勻添加進96孔板內，孵育過夜后，分別加入2、4、8、16、32、64、128、256、512 μmol·L-1SIN，24 h后加入10 μL 5 g·L-1MTT。培養4 h后棄去上清液，添加100 μL DMSO，使用酶標儀(570 nm)測量吸光度(OD)值。計算細胞生存率。

1.5.1.2 DBT毒性實驗 將HL02細胞孵育過夜后分別加入0.25、1、4、16、32 μmol·L-1DBT孵育24 h。按相同方法計算細胞生存率。

1.5.1.3 SIN保護活性實驗 HL02細胞經SIN(4、8、16 μmol·L-1)培養24 h后加入3 μmol·L-1DBT孵育6 h，測定OD值。計算細胞生存率。

1.5.2形態學觀察 HL02細胞經過DBT以及SIN處理后，使用倒置顯微鏡(×40)觀察，拍照。

1.5.3AO/EB染色法 HL02細胞經過DBT以及SIN處理后，添加1 g·L-1AO和EB溶液，暗處孵育15 min，用冷的PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察后拍照。

1.5.4Annexin V-FITC/PI雙染法 使用DBT及不同濃度的SIN處理HL02細胞，收集細胞，避光染色。檢測細胞凋亡率。

1.5.5ROS含量測定 HL02細胞經DBT及不同濃度的SIN處理后，加入到10 μmol·L-1DCFH-DA溶液中，37 ℃孵育半小時，反復清洗3次后檢測熒光強度。結果用實驗組與對照組的平均熒光強度表示。

1.5.6線粒體膜電位檢測 將JC-1、超純水和染色緩沖液按1 ∶160 ∶40比例配置工作液。取1 mL工作液加入處理后的HL02細胞樣品中，37 ℃孵育20 min，PBS清洗重懸，檢測熒光強度。

1.5.7實時熒光定量PCR 處理后的HL02細胞提取總RNA，并使用酶標儀測量RNA濃度和純度。之后，按照反轉錄試劑盒的程序獲得到cDNA。基因的相對含量表示為2-ΔΔCt。引物序列如Tab 1所示，內參基因是GAPDH。

1.5.8蛋白印記 收集處理后的HL02細胞，加入裂解液，12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，定量，等量等體積蛋白加到上樣孔中進行電泳分離。隨后用5%脫脂牛奶封閉1.5 h，一抗在4℃孵育12 h后，二抗室溫培養1 h，顯影，曝光。

Tab 1 Primer sequence

2 結果

2.1 SIN對DBT誘導HL02細胞毒性的保護效果結果如Fig 1所示，HL02細胞在不同濃度的SIN(2～512 μmol·L-1)中培養12 h后，濃度低于128 μmol·L-1的SIN未對HL02細胞的增殖顯示抑制效果。經過DBT單獨處理，細胞活力呈濃度依賴性降低，IC50值為2.96 μmol·L-1。相比對照組，DBT處理組的細胞存活率明顯下降，而使用SIN預處理可以顯著提升細胞存活率，差異有統計學意義(P<0.01)。形態學觀察結果顯示，DBT處理組HL02細胞變小呈圓珠狀，而不同濃度SIN預處理后形態改變的細胞逐漸減少。

2.2 SIN對DBT誘導HL02細胞凋亡的影響結果如Fig 2所示，HL02細胞經DBT處理后核染色質為桔紅色并呈固縮狀，而不同濃度SIN的預處理后，上述現象逐漸減少。模型組中細胞凋亡率為(25.37±0.87)%，而不同濃度SIN預處理后，細胞凋亡率分別降為對照組(22.30±0.50)%、(18.30±1.04)%、(13.07±1.82)%，與單獨使用DBT處理相比較，SIN組凋亡率明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 SIN對DBT誘導HL02細胞內ROS含量及MMP的影響實驗結果顯示(Fig 3)，模型組中細胞內ROS為對照組的(1.99±0.07)倍，而經過不同濃度SIN預處理后，細胞內ROS含量降低至對照組的(1.75±0.04)、(1.46±0.04)、(1.25±0.04)倍。同時，單獨使用DBT處理降低MMP至對照組的(0.41±0.04)倍。而經不同濃度的SIN預處理后加入DBT，電位差明顯發生改變，分別增長為對照組的(0.54±0.03)、(0.71±0.05)、(0.83±0.04)倍。

2.4 SIN對凋亡相關基因表達的影響采用qRT-PCR技術檢測Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、cytochome c、

Fig 1 The protective effect of SIN on DBT-induced cytotoxicity of HL02 A：Toxicity of SIN on HL02 cells；B：Toxicity of DBT on HL02 cells；C：The protective effect of SIN on the decline of HL02 cell viability induced by DBT；D：Cell morphology observation results.#P<0.05，##P<0.01 vs control；**P<0.01 vs model.

Fig 2 SIN reduced increase of DBT-induced HL02 cell A：The characteristics of cell apoptosis observed by AO/EB fluorescence staining；B：Cell apoptosis rate detected by Annexin V-FITC/PI double staining；C：The corresponding quantitative data of B.##P<0.01 vs control;*P<0.05，**P<0.01 vs model.

Apaf-1、caspase-9和caspase-3 的mRNA表達水平。結果顯示(Fig 4)，DBT能明顯增加Bad、Bax、cytochome-c、Apaf-1、caspase-9和caspase-3的mRNA水平、降低Bcl-xL和Bcl-2的mRNA水平。而不同濃度SIN的預處理能明顯逆轉上述結果，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.5 SIN對凋亡相關蛋白的影響結果如Fig 5所示，經過DBT單獨處理，HL02細胞中的Bcl-2/Bax比例明顯降低。相比之下，SIN的預處理后二者比例隨SIN濃度的提高而升高(P<0.01)。同時，caspase-9與cleaved-caspase-3的表達也降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

自三取代有機錫化合物因高毒性被禁止使用以來，二取代有機錫化合物逐漸發展。其中，二氯二丁基錫的應用十分廣泛。本課題組對有機錫類化合物的藥理和毒理研究過程中發現：二氯二丁基錫對肝細胞表現出明顯的毒性。該毒性可能源于自由基引起的氧化損傷。在對DBT誘導肝細胞毒性的治療過程中，我們檢測了多種中藥活性成分，從中篩選發現青藤堿具有一定的保護活性。近期有研究表明，青藤堿可以通過抑制氧化應激，凋亡和炎癥發揮肝保護作用[8]。

氧化應激是肝細胞損傷重要的機制之一[9]。過量的ROS可與生物大分子發生反應，使之失活，最終導致細胞損傷。有研究表明，三苯基錫(TPT)可以誘導HepG2肝細胞產生過量ROS，誘導DNA損傷(DNA斷裂)，產生細胞毒性[10]。然而，據文獻報道青藤堿具有抗氧化應激活性。例如：近期Fang等[8]報道，青藤堿可以通過抑制氧化應激，凋亡和炎癥等機制，對乙醇誘導的小鼠肝損傷發揮保護作用；Fan等[11]報道，青藤堿可通過激活PC12細胞的內源性抗氧化機制減輕H2O2導致的細胞毒性。因此，我們推測青藤堿可能通過激活肝HL02細胞內源性抗氧化機制，清除細胞內產生的過量ROS，從而保護線粒體，降低肝細胞凋亡率。本實驗結果也證實了DBT誘導的HL02細胞內ROS的過量產生能夠經過SIN的預處理得到減輕。

Fig 3 SIN reduced DBT-induced ROS production and MMP depolarization in HL02 (A，C)The result of intracellular ROS and MMP measured by flow cytometry.(B，D)The corresponding quantitative data of(A，C).##P<0.01 vs control;*P<0.05，**P<0.01 vs model.

在凋亡發生的初期，細胞內過量ROS可以降低抗凋亡蛋白表達、上調促凋亡的蛋白表達。這引起MMP下降與線粒體膜通透性增強[12]。進而導致細胞質中cytochrome-c蛋白增多。其可以和Apaf-1聚合為凋亡體[13]。凋亡體可以激活caspase-9形成cleaved-caspase-9。cleaved-caspase-9進一步誘導下游的caspase-3活化形成cleaved-caspase-3并最終可導致細胞程序性死亡。有研究表明，一些mRNA的表達水平能夠反映相應蛋白質的表達水平[14]。本實驗結果表明，DBT處理組中Bcl-2和 Bcl-xL的mRNA表達降低，而Bax、Bad、cytochrome c、Apaf-1、caspase-9和caspase-3的mRNA表達升高。經過不同濃度SIN的預處理，上述結果發生逆轉。Western blot結果也證實SIN能夠顯著提升Bcl-2與Bax的比值、降低caspase-9與cleaved-caspase-3的表達。

綜上所述，本研究結果表明，SIN能夠有效降低DBT誘導的HL02細胞損傷，其機制與抑制ROS介導的線粒體凋亡有關。

Fig 4 The mRNA expression of apoptosis-related ##P<0.01 vs control；**P<0.01 vs model.

Fig 5 Expression of apoptosis-related (A，B)The expression of Bcl-2，Bax，caspase-9 and cleaved-caspase-3 proteins.(C，D)The corresponding quantitative data of(A，B).##P<0.01 vs control;*P<0.05，**P<0.01 vs model.