DNMT3A調控Drp1對肝星狀細胞活化增殖和遷移能力的影響

王 娟，孫 峰，楊晶晶，魯 超

(1.安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥 230032；2.安徽醫科大學第二附屬醫院藥物臨床試驗研究中心，安徽 合肥 230601; 3.安徽理工大學第一附屬醫院，安徽 淮南 232001)

肝纖維化(hepatic fibrosis)是營養代謝和病毒感染等引發的慢性肝臟疾病，最終導致細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在肝臟中過度積聚[1-2]。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝纖維化發生的主體細胞類型，其活化會影響肝纖維化疾病的轉歸，但目前關于HSCs活化的分子機制尚未了解完全[3]。證據表明，線粒體裂變在細胞活化增殖和纖維化疾病中發揮重要作用[4-5]。線粒體裂變(mitochondrial fission)是指一個線粒體變成兩個線粒體，并且外膜完全分離，與線粒體融合動態變化維持線粒體穩態[6-7]。在哺乳動物細胞里，這個過程主要由線粒體動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)來介導的。Wang等[4]研究表明，Drp1在活化的成纖維細胞中表達上調，提示Drp1表達上調促進了成纖維細胞的活化增殖，但Drp1是否參與調控HSCs活化增殖尚不清楚，值得進一步研究。

研究表明表觀遺傳修飾在線粒體裂變中發揮重要作用，可通過調控Drp1的表達來調節線粒體裂變的發生促進纖維化發生發展[8]。作為DNA甲基化關鍵酶之一的DNA甲基轉移酶3A(DNA methyltransferase 3A，DNMT3A)在HSCs活化增殖中發揮重要作用[9-10]。那么在活化的HSCs中Drp1的表達升高是否是由DNMT3A介導的甲基化修飾引起的？DNMT3A是否通過調控Drp1從而促進HSCs活化增殖及肝纖維化？這一科學問題目前尚未見報道，值得我們進一步研究。本研究擬通過探究DNMT3A對Drp1的調控，并觀察對HSCs活化增殖和遷移能力的影響，明確DNMT3A是否通過調控Drp1介導的線粒體裂變促進HSCs活化，從而為肝纖維化的臨床治療提供新的理論依據和作用靶點。

1 材料

1.1 細胞株大鼠肝星狀細胞株(HSC-T6)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物處理TGF-β1購自PeproTech公司。實驗前先用檸檬酸鹽緩沖液(10 nmol·L-1，pH 3.0)配成濃度為0.1 g·L-1的儲備液，置于-20 ℃冰箱保存；臨用時稀釋成濃度為2 mg·L-1的工作液，置于4 ℃冰箱保存。

1.3 主要試劑DMEM 培養基(Hylcone)、胎牛血清(Gibco，USA)；胰蛋白酶(Multicell)；Transwell小室(Corning)；CCK-8試劑盒(Biosharp)；BCA試劑盒(碧云天)；TRIzol試劑(Invitrogen)；逆轉錄和RT-qPCR試劑盒(艾科瑞生物)；兔源一抗GAPDH、CollagenⅠ、α-SMA、Drpl和Fis1(Proteintech)；兔源一抗DNMT3A(Abcam)；兔源二抗(Bioworld)。引物序列由上海生工公司合成，見Tab 1。

1.4 主要儀器細胞培養超凈工作臺(蘇州凈化)；高壓滅菌鍋(博迅)；倒置熒光顯微鏡(蔡司)，CO2培養箱(賽默飛)，實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)，酶標儀(Varioskan LUX)，低溫離心機(德國艾本德)；電子天平(賽多利斯)。

Tab 1 The primer sequences

2 方法

2.1 細胞培養采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，置于37 ℃,5% CO2培養箱中孵育，培養至鋪滿瓶底，然后傳代，保留5代后方可進行后續實驗研究。

2.2 TGF-β1誘導HSCs細胞活化HSC-T6細胞以30%的密度接種于6孔板，于37 ℃的CO2培養箱中培養過夜；次日用含5 μg·L-1TGF-β1的無血清DMEM培養基替代，再培養24 h。待其他分組處理后收集細胞，制作提取RNA和總蛋白的樣品。

2.3 DNMT3A慢病毒轉染按照吉瑪基因慢病毒操作手冊，首先通過預實驗確認感染方法和感染參數。將對數期的HSC-T6消化計數至1×108L-1鋪板于6孔板中，貼壁后用5 μg·L-1TGF-β1刺激24 h活化。取DNMT3A慢病毒，按MOI值為30的滴度與無血清培養基混合稀釋，并加入終濃度為5 mg·L-1的Polybrene(聚凝胺)用來增加轉染效率；同時設置相同MOI滴度的病毒陰性對照組；24 h后更換新鮮培養基，感染72 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光并用于后續實驗。

2.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)細胞如上處理后，每孔加入1 mL TRIzol試劑慢提RNA。于260 nm波長處檢測其濃度，按照試劑盒(艾科瑞)要求以不超過50 mg·L-1濃度進行逆轉錄得cDNA。再按照qPCR試劑盒(艾科瑞)要求混合液體，以兩步法PCR反應程序進行擴增，以GAPDH作為內參，2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量。

2.5 Western blot細胞分組處理后加入RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE蛋白電泳，轉膜，脫脂牛奶封閉，洗膜，4 ℃過夜孵育一抗，次日取出洗膜，室溫孵育二抗1 h，洗膜，用ECL法顯影。結果采用ImageJ軟件進行灰度值分析，以GAPDH作為內參，實驗重復3次。

2.6 細胞增殖實驗(CCK-8)用胰蛋白酶消化對數生長期細胞，制備細胞懸液。以每孔2 000個接種于96孔板中，置于5%CO2培養箱中37 ℃下培養4 h，貼壁后進行后續處理，每組設6個復孔，用無菌PBS填充邊緣孔。慢病毒轉染結束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，輕輕敲擊混勻96孔板，在培養箱中孵育2 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度。根據增殖率/%=(實驗組 - 空白對照)/(陰性對照 - 空白對照)×100%計算，實驗重復3次。

2.7 細胞劃痕實驗按“2.3”處理后的細胞以過夜長滿的密度鋪在提前在底部劃橫線的6孔板上，48 h后用200 μL的無菌槍頭垂直底部平行線進行劃痕，用PBS清洗3～4次后，加入無血清DMEM，置于37 ℃的5% CO2培養箱中。分別用倒置顯微鏡觀察0 h，48 h傷口寬度的變化規律，并對劃痕面積進行ImageJ統計。遷移率/%=(初始劃痕面積-48 h后劃痕面積)/初始劃痕面積×100%，每孔隨機選取3個視野，每孔重復3次。

2.8 Transwell遷移實驗Transwell下室提前1 h加入無血清培養基進行基底膜水化。將慢病毒處理好的各組細胞用胰酶消化離心，然后重懸于DMEM中，并稀釋為5×108L-1。取100 μL接種于上室中，并加入適量10%FBS于下室，孵育30～40 h。小室洗滌后用4%的多聚甲醛室溫固定30 min，晾干；隨后用0.1%的結晶紫水溶液室溫下染色20 min。用棉簽輕輕除去上室膜細胞，洗滌后每孔任意選擇5個視野進行拍照，用ImageJ進行計數分析，每組3個復孔，取平均值。

2.9 統計學分析采用 Graphpad Prism 6.0軟件進行統計分析。組間差異采用t檢驗和單因素方差分析。

3 結果

3.1 DNMT3A在HSCs細胞中的表達情況在用TGF-β1刺激HSC-T6細胞后，DNMT3A的含量升高，結果如Fig 1所示。用MOI值為30的DNMT3A慢病毒感染72 h后，Fig 1A，B結果顯示，與NC組比較，病毒感染組DNMT3A水平明顯降低(P<0.01)，病毒感染成功，DNMT3A沉默模型成功構建。

Fig 1 Expression of DNMT3A in each group after lentivirus infection n=3)A：qPCR of DNMT3A;B：Western blot of DNMT3A,1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+LV5-NC；4：TGF-β1+LV5-DNMT3A;*P<0.05,**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs TGF-β1+ LV5-NC group.

3.2 DNMT3A調控collagen Ⅰ，α-SMA mRNA的表達Fig 2結果顯示，用TGF-β1刺激HSCs細胞后，與正常組相比，Collagen Ⅰ、α-SMA mRNA含量明顯升高(P<0.05)；而DNMT3A慢病毒感染后，Collagen Ⅰ、α-SMA mRNA含量明顯低于NC組(P<0.01)，提示DNMT3A被抑制，HSCs的活化也被抑制。

3.3 DNMT3A調控collagen Ⅰ，α-SMA 蛋白的表達Fig 3結果顯示，用TGF-β1刺激HSCs細胞后，與正常組比較，Collagen Ⅰ，α-SMA蛋白含量明顯升高(P<0.01)，HSCs被活化；而DNMT3A慢病毒感染后，Collagen Ⅰ、α-SMA蛋白水平明顯低于NC組(P<0.01)，提示DNMT3A被抑制，纖維化水平被抑制。

Fig 2 Effect of DNMT3A on collagen Ⅰ,*P<0.05,**P<0.01 vs Control group;#P<0.05 vs TGF-β1+ LV5-NC group.

Fig 3 Effect of DNMT3A on expression of collagen Ⅰ,1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+LV5-NC；4：TGF-β1+LV5-DNMT3A.*P<0.05，**P<0.01 vs Control group.##P<0.01 vs TGF-β1+ LV5-NC group.

3.4 DNMT3A調控Drp1 mRNA的表達Fig 4結果顯示，用TGF-β1刺激HSCs細胞后，與正常組比較，Drp1 mRNA的含量明顯升高(P<0.01)；而DNMT3A慢病毒感染后，Drp1 mRNA含量明顯低于NC組(P<0.05)，提示DNMT3A被抑制，線粒體裂變也被抑制。

3.5 DNMT3A調控Drp1蛋白的表達Fig 5結果顯示，用TGF-β1刺激HSCs細胞后，與正常組比較，Drp1蛋白含量明顯升高(P<0.01)；而DNMT3A慢病毒感染后，Drp1蛋白含量明顯低于NC組(P<0.01)，提示DNMT3A被抑制，與線粒體裂變有關的蛋白也被抑制。

Fig 4 Effect of DNMT3A on Drp1 mRNA expression n=3)1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+LV5-NC；4：TGF-β1+LV5-DNMT3A.**P<0.01 vs Control group;#P<0.05 vs TGF-β1+LV5-NC group.

Fig 5 Effect of DNMT3A on expression of 1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+LV5-NC；4：TGF-β1+LV5-DNMT3A.**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs TGF-β1+LV5-NC group.

3.6 DNMT3A調控HSCs的增殖Fig 6結果顯示，用TGF-β1刺激HSCs細胞后，與正常組比較，細胞活化增殖活性明顯升高(P<0.01)；而DNMT3A慢病毒感染后，細胞活化增殖活性明顯低于NC組(P<0.01)，提示DNMT3A被抑制，細胞活化增殖活性也被抑制。

3.7 DNMT3A調控HSCs的遷移Transwell遷移實驗結果顯示，用TGF-β1刺激HSCs細胞后，細胞遷移能力較正常組明顯升高(P<0.01)；而DNMT3A慢病毒感染后，細胞遷移能力明顯低于NC組(P<0.01)，提示DNMT3A被抑制，細胞遷移能力也被抑制(Fig 7A)。如Fig 7B所示，劃痕實驗也證實了上述結果。

Fig 6 Effect of DNMT3A on HSCs proliferation n=6)1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+LV5-NC；4：TGF-β1+LV5-DNMT3A.**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs TGF-β1+ LV5-NC group.

4 討論

線粒體的生物發生和動力學是協調的，為保持線粒體穩態，線粒體分裂蛋白會做相應的表達變化[7]。Drp1是線粒體裂變的標志性分子，其在線粒體發生分裂過程中合成和表達增多且它的功能是必需的[11]。已有文獻報道，Drp1在腎臟和血管纖維化中發揮重要作用，Drp1的上調會導致線粒體裂變增加，進而促進纖維化細胞活化增殖，促進纖維化發展[4-5]。但Drp1在肝纖維化中的作用不明確。Das等[12]研究表明，線粒體裂變的增加可促進HSCs的活化增殖，HSCs活化增殖的增強可進一步促進肝纖維化的發生發展。本研究結果發現，活化的HSCs中Drp1的合成和表達增多，提示Drp1介導的線粒體裂變可能在HSCs的活化過程中發揮重要作用，調控Drp1的關鍵分子可能是抗肝纖維化的潛在靶點。但具體機制有待進一步研究。

DNMT3A作為一種穩定可遺傳的表觀遺傳機制，在基因組中通過CpG島從頭甲基化過程來調控纖維化的發生發展[13-14]。然而，DNMT3A在HSCs活化和肝纖維化進展中的作用在國內外很少報道。我們課題組前期的研究發現，DNA甲基化與HSCs的增殖狀態密切相關，可參與調控HSCs活化增殖[15]。在本實驗中，使用TGF-β1刺激HSCs后，Collagen Ⅰ和α-SMA表達升高，細胞的增殖和遷移能力增強，說明HSCs活化增殖模型建立成功，此時DNMT3A水平顯著升高，提示在活化的HSCs中DNMT3A可能發揮重要作用。

Du等[16]的研究表明，表觀遺傳修飾調控線粒體裂變在肝臟缺血/再灌注中發揮重要作用，但DNMT3A是否調控Drp1介導的線粒體裂變促進HSCs活化增殖還未見報道。為了進一步明確DNMT3A和Drp1的關系，我們利用慢病毒感染沉默DNMT3A后發現，HSCs合成的collagen Ⅰ、α-SMA的表達下調，并且HSCs細胞的增殖和遷移能力受到抑制，同時Drp1的含量也明顯降低，提示沉默DNMT3A可以抑制Drp1表達，同時有效地降低了HSCs增殖與遷移能力。實驗結果提示，DNMT3A在Drp1的表達調控中具有重要的作用，DNMT3A可能通過影響線粒體裂變發揮抑制HSCs活化作用。

Fig 7 Effect of DNMT3A on HSCs migration ability n=5)A:Representative results of transwell migration (×200).B:Representative results of wound healing (×200).C:Statistical analysis of the effect of DNMT3A on HSCs on the migration ability;D:Statistical analysis of the effect of DNMT3A on HSCs on the migration and healing ability.1：Control；2：TGF-β1；3：TGF-β1+LV5-NC；4：TGF-β1+LV5-DNMT3A.*P<0.05，**P<0.01 vs Control group.##P<0.01 vs TGF-β1+LV5-NC group.

綜上，DNMT3A可能通過調控Drp1介導的線粒體裂變促進肝星狀細胞活化增殖和遷移能力，進而促進肝纖維化發生。預期研究成果將有利于從表觀遺傳學方向結合線粒體裂變角度深入理解肝纖維化發病的分子作用機制，從而為肝纖維化的臨床治療提供新的理論依據和新的作用靶點。