基于網絡藥理學方法和分子對接技術探討刺梨治療高血脂癥的作用機制

季嘉城，袁敏艷 ，張 碩，唐 麗 ，王鵬嬌 ，張 敏，3，高秀麗，3，4

(1.省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室/貴州醫科大學藥學院，2.貴州醫科大學實驗動物中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州高等學校微生物與生化藥學工程中心，4.貴州省食品營養與健康工程研究中心，貴州 貴陽 550025)

高血脂癥(hyperlipidemia)以血清脂質或脂蛋白異常為特征，主要表現為總膽固醇和甘油三酯水平升高[1]。隨著現代飲食結構的變化，高脂血癥的發病率出現了顯著提升，高血脂癥已成為一個重要的公共衛生問題[1]。目前，主要用于高血脂癥的為他汀類藥物、膽汁酸螯合劑等藥物，但是長期服用會帶來嚴重如橫紋肌溶解、腹瀉等不良反應[2-3]。因此，藥物的有效性和安全性仍有待探索，新的高血脂癥的干預或者治療策略也有待進一步的發現。

刺梨(RosaroxburghiiTratt)作為一種藥食同源民族藥，被收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》中。刺梨富含各種營養和功能成分，包括黃酮類化合物、維生素C、三萜類化合物、有機酸、多酚類化合物和超氧化物歧化酶[4]。近年來，由于刺梨具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化和抗腫瘤的作用[5]，它已引起越來越多的關注。目前，對于刺梨治療高血脂癥研究及作用機制研究比較欠缺。本研究結合藥效學實驗和網絡藥理學-分子對接，初步探索了刺梨對高血脂癥的治療作用和可能的作用機制，為深入研究藥效物質基礎、作用機制以及臨床應用提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 刺梨降血脂作用研究

1.1.1高血脂大鼠模型的構建 刺梨原汁由“貴農5號”鮮果壓榨得到，采用比色法和HPLC法(Agilent Technologies，USA)測定總多酚含量為(31.26±0.13) g·L-1、總黃酮含量為(9.59±0.15) g·L-1、總多糖含量為(14.52±0.20) g·L-1、維生素C含量為(13.45±0.09) g·L-1。雄性Sprague-Dawley大鼠(180～200 g，SPF)購自貴州醫科大學動物中心(許可證號：SYXK(黔)2018-0001)，實驗所用刺梨均為同一型號、同一批次。動物實驗得到了貴州醫科大學動物實驗中心和貴州醫科大學動物倫理委員會的批準，并按照國家實驗動物福利和動物實驗倫理要求的準則進行。18只SD大鼠適應性飼養1周，將18只隨機分為空白組(n=6)和高脂組(n=12)，空白組喂普通飼料，高脂組大鼠高脂飼料喂養8周，高脂飼料(18%豬油、2%膽固醇、0.2%膽汁鹽和79.8%基礎飼料)，血清TG、TC水平與空白組具有顯著性差異，視為造模成功。造模期間自由飲食飲水，造模成功大鼠分為2組(n=6)，分別為模型組和刺梨組，根據大鼠體重調整灌胃劑量，刺梨組給予刺梨原汁灌胃10 mL·kg-1，模型組與空白組灌胃等量生理鹽水。空白組給予基礎飼料，模型組和刺梨組給予高脂飼料。實驗期間大鼠自由飲食飲水，每周記錄體重，治療周期為3個月。

1.1.2理化指標測定 將血樣在室溫(24±2) ℃下放置1 h，在4 ℃下以3 000 r·min-1離心10 min，分離血清并儲存在-20 ℃。血清脂質指標包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)(南京市建成生物工程研究所，中國南京)使用商業試劑盒進行測量。

1.1.3肝臟組織切片分析 解剖摘取各組大鼠肝臟，經4%多聚甲醛固定、脫水、包埋、切片、染色、封片，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察肝臟組織結構。

1.2 刺梨治療高血脂癥網絡藥理學分析

1.2.1刺梨的活性成分庫建立 由于中草藥系統藥理學平臺(TCMSP)數據庫未收錄“刺梨”，根據已發表的有關刺梨成分的文獻，書籍，并結合中藥與化學成分數據庫(http：//www.chemcpd.csdb.cn/cmpref/main/tcm_introduce.asp)，收集了刺梨的化學成分。利用PubChem數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找收集的化學成分的2D結構的SDF文件，將該文件導入SwissADME(http：//www.swissadme.ch)了解成分的胃腸道吸收性、類藥性以及能否穿透血腦屏障，篩選條件：GIabsorption為Yes、Druglikeness(包括Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)5項特性中3項為Yes；符合篩選條件的有效成分。通過SwissTargetPrediction (http：//www.swisstargetprediction.ch/)數據庫搜集的作用靶點。利用UniProt數據庫(http：//www.uniprot.org/)對所有靶基因名稱進行校正，獲得靶點信息。

1.2.2靶點庫建立 以“Hyperlipidemia”為檢索詞，對DrugBank數據庫(https：//www.drugbank.ca)、Online Mendelian Inheritance in Man Database(OMIM)數據庫(https：//www.omim.org)、GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org)進行檢索，合并數據庫的過濾結果，刪除重復靶點，獲得高血脂癥相關基因靶點。

1.2.3刺梨降血脂潛在靶點的預測 利用在線工具Venny2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對刺梨的作用靶點與高血脂相關基因靶點互相映射，得到二者的交集靶點，即刺梨降血脂的潛在靶點。

1.2.4蛋白-蛋白相互作用網絡的構建和關鍵靶點的篩選 將刺梨治療高血脂的潛在靶點導入STRING數據庫(https：//string-db.org/)構建PPI網絡。蛋白物種設置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設置為“high confidence>0.9”，并隱藏游離的靶標，其余參數保持默認設置，得到靶蛋白之間的PPI網絡圖及相互信息數據表，利用Cytoscape3.7.2軟件中Network Analyzer插件對以上結果進行網絡拓撲參數分析。

1.2.5“中藥-活性成分-潛在靶點”網絡的構建 將刺梨的主要活性成分與潛在靶點導入Cytoscape3.7.2軟件中，繪制“中藥-活性成分-潛在靶點”網絡。

1.2.6關鍵靶蛋白GO富集分析和KEGG通路分析 使用DAVIDV6.8數據庫(https：//david.ncifcrf.gov)對潛在的治療靶標基因進行基因本體(Gene Ontology，Go)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，獲得刺梨治療高血脂的生物學過程、細胞組分、分子功能和相關信號通路關系。

1.2.7分子對接 通過Pubchem網站(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索獲取化合物的SDF結構文件，并利用Open Babel 2.3.2軟件將SDF文件轉化為PDB文件，從Protein Data Bank (http：//www.rcsb.org/pdb)數據庫中檢索獲得受體蛋白RXRA(PDB：3NSQ)、AKT1(PDB：4EKL)、ESR1(PDB：5GS4)、PIK3R1(PDB：4WAF)，利用PYMOL 2.3.4軟件對受體蛋白進行去水、去配體等操作，采用AutoDockTools軟件對受體蛋白進行加氫、平衡電荷等修飾，利用AutoDock Vina 1.1.2對受體蛋白與配體小分子進行分子對接，結合能打分。

2 結果

2.1 刺梨降血脂作用研究

2.1.1刺梨對血脂的影響 由Tab 1知，與空白組比，模型組血清TC水平、TG水平、LDL-C水平明顯升高(P<0.05)，HDL-C水平明顯下降(P<0.05)，表明高脂飼料喂養的大鼠出現血脂異常。經刺梨治療后，與模型組比，刺梨組TC、TG、LDL-C水平明顯下降(P<0.05)，HDL-C水平明顯增加(P<0.05)，與空白組相比差異無顯著性(P>0.05)。以上研究結果表明，刺梨能明顯改善高脂飼料誘導的大鼠血脂異常、維持血脂水平穩定。

Tab 1 Effect of Rosa roxburghii Tratt on body weight and serum biochemical index of

2.1.2刺梨對肝臟功能的影響 肝臟指數在一定程度上可以反映肝臟的健康狀況。高血脂組的肝臟指數均明顯高于空白組(P<0.05)，說明脂肪在肝臟積聚較為嚴重，給藥刺梨后，肝臟指數明顯降低，見Tab 1。HE染色顯示，模型組肝小葉結構嚴重紊亂，只有少部分肝小葉結構正常，脂肪空泡占整個視野區域面積小于3/4，脂肪空泡相互融合成片；脂肪空泡集中區域部分肝細胞體積增大，細胞質著色淺，部分細胞壞死，細胞核溶解。經過刺梨治療后肝小葉清晰可見，肝細胞間分布的大小不等的脂肪空泡減少(Fig 1)。結果表明，刺梨汁能顯著改善高脂飼料誘導的大鼠肝臟功能的損傷。

2.2 網絡藥理學及分子對接

2.2.1刺梨活性成分及相關靶標獲取 通過已發表的有關刺梨成分的文獻，并結合中藥與化學成分數據庫檢索得到主要活性化合物14個，槲皮素、棕櫚酸、原兒茶酸、沒食子酸、丁香酸、4-羥基苯甲酸、咖啡酸、鞣花酸、山奈酚、月桂酸、β-谷甾醇、Roxburic acid、α-亞麻酸、4-羥基肉桂酸，共對應347個靶標。

2.2.2高血脂相關靶標篩選和交集靶標獲取 將Genecard數據庫、OMIM數據庫和Drugbank數據庫檢索到的高血脂的靶標結果合并，去除重復值，獲得高血脂相關基因疾病靶點1 489個，使用Venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對347個刺梨藥物靶點與1 489個高血脂相關基因靶點進行互相映射，獲得129個刺梨治療高血脂癥的交集靶點，如Fig 2。

2.2.3“中藥-活性成分-潛在靶點”網絡 將交集靶點、活性成分、中藥信息導入Cytoscape3.7.2軟件進行可視化分析處理，獲得“中藥-活性成分-潛在靶點”網絡圖，如Fig 3。

2.2.4PPI網絡和關鍵靶點 將刺梨治療高血脂癥的129個潛在靶點導入STRING數據庫，限定物種為Homo Sapiens，設置最低置信度為0.9，同時隱藏游離的點，靶蛋白相互作用信息導入Cytoscape3.7.2軟件中，進行可視化分析，構建PPI網絡關系圖，見Fig 3，該網絡關系圖中，包含104個節點和534條邊。利用“Analyze Network”功能對PPI網絡進行拓撲分析，計算出各節點的度值(degree)、介數中心性(Between nesscentrality，BC)和接近中心性(Closeness centrality，CC)，其中degree的中位數為4，BC的中位數為0.0049，CC的中位數為0.3055，以degree≥4且BC≥0.0049且CC≥0.3055為篩選出符合的靶蛋白有30個，即為刺梨治療高血脂的關鍵靶點，見Fig 4和Tab 2。按照度值對關鍵靶蛋白進行排序，將前4個靶點作為核心靶點即RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1。

Fig 1 HE staining of liver tissues of rats(×20)A:Control;B:Model;C:Rosa roxburghii Tratt

Fig 2 Venn diagram of Rosa roxburghii Tratt hyperlipidemia target

Fig 3 Traditional Chinese medicine -active ingredients-potential therapeutic targets

2.2.5GO富集分析 為進一步闡明交集靶點的潛在作用，本研究通過對交集靶點進行富集分析。運用David數據對刺梨降血脂的潛在靶點進行GO生物學過程富集分析。GO包括生物學過程(BP)，分子功能(MF)以及細胞組分(CC)，共富集到262條GO條目，其中包括190條生物學過程，54條分子功能和18條細胞組分，見Fig 5。生物學過程涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II pro-moter)、凋亡過程的負調控(negative regulation of apoptotic process)、信號傳導(signal transduction)、類固醇激素介導的信號通路(steroid hormone mediated signaling pathway)、蛋白質磷酸化的正向調控(positive regulation of protein phosphorylation)等。

Fig 4 Protein interaction network of therapeutic targets of Rosa roxburghii Tratt

Tab 2 Key protein topological parameters of protein-protein interaction network

Fig 5 GO functional enrichment analysis

2.2.6KEGG富集分析 KEGG分析主要涉及癌癥通路(Pathways in cancer)、癌癥蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、甲狀腺激素信號通路(Thyroid hormone signaling pathway)、非酒精性脂肪肝疾病(Non-alcoholic fatty liver disease)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、TNF-信號通路(TNF signaling pathway)等，見Fig 6。

Fig 6 Top20 of KEGG enrichment result

2.2.7分子對接 從成分-核心靶點網絡中將基因靶點以 degree 值高低進行排序，選取前4個關鍵靶點(RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1)，分別與刺梨治療高血脂癥的2個關鍵藥效成分(Roxburic acid和α-亞麻酸)進行分子對接，對接結合能如表Tab 3所示。2個關鍵藥效成分與4個靶標蛋白的結合能均小于0，其中刺梨酸與4個關鍵靶點的結合很好，均小于-5 kcal·mol-1，提示分子間具有很好的結合活性。其對接結果進行可視化如Fig 7所示，見Tab 3。通過Discovery Studio和 PyMOL對結合能最低的組合進行相互作用模式分析，受體蛋白AKT1與Roxburic acid配體小分子之間的結合模式，氨基酸殘基Asp292、Asp274與Roxburic acid配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Lys276、Thr312、Leu295、Gly311、Cys310、Phe309、Glu191、Phe161與Roxburic acid配體小分子形成疏水相互作用，共同維持和AKT1之間的穩定構象。

Tab 3 The docking score of Rosa roxburghii Tratt active component and target protein

3 討論

本文通過構建高血脂大鼠模型，研究刺梨對高血脂大鼠的治療作用，結果表明，刺梨明顯降低了高血脂癥大鼠體重，血清TC水平、TG水平、LDL-C水平明顯(P<0.05)，明顯提高了HDL-C水平(P<0.05)，同時刺梨顯著改善了高血脂飲食引起的肝臟功能的損傷，綜上所述，刺梨具有很好的治療高血

Fig 7 Molecular docking model of Roxburic acid with target proteinA：Docking results of AKT1-Roxburic acid;B：Docking results of ESR1-Roxburic acid;C：Docking results of RXRA-Roxburic acid;D：Docking results of PIK3R1-Roxburic acid

脂癥的作用。

本研究共篩選出刺梨活性成分14個，其中主要活性成分有Roxburic acid、α-亞麻酸、山奈酚、槲皮素、鞣花酸等，α-亞麻酸是一種主要來源于植物的ω-3多不飽和脂肪酸，補充α-亞麻酸可明顯改善血脂水平，降低心血管疾病的風險[6-7]；山奈酚通過調節脂質代謝、增加能量消耗來改善肥胖[8-9]；槲皮素對肥胖、脂代謝、糖代謝和氧化應激均有明顯的影響[9]；鞣花酸具有改善血脂異常、抗腫瘤、抗突變及抗炎等作用[10]。

通過PPI 網絡拓撲分析得出30個核心靶點，涉及RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1、PIK3CA、RXRG、RXRB、TNF等30個核心靶點，對30個核心靶點進行GO功能和 KEGG 通路富集分析。KEGG 富集通路主要涉及PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路、非酒精性脂肪肝疾病、MAPK信號通路、TNF-信號通路等，這些通路在調節能量代謝中發揮著重要的作用。

本研究將篩選出的核心成分與關鍵靶點分子對接，2個關鍵藥效成分與4個靶標蛋白的結合能均小于0，提示刺梨中的核心成分與關鍵靶點有著較好的結合活性，說明它們可能是治療高血脂癥的潛在活性成分。RXRA是核配體激活轉錄因子家族成員，參與脂肪酸代謝、膽固醇代謝等多個生物過程，調節脂質代謝中的穩態[11-12]。ESR1介導SCL2A4基因表達來影響著脂肪的正常轉化，從而發揮調節血糖代謝紊亂的作用[13-14]。AKT1和PIK3R1通過影響PI3K/AKT信號轉導通路中發揮著調節能量穩態，調節脂肪酸合成的作用[15-17]。分子對接結果顯示，RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1與Roxburic acid與α-亞麻酸具有很好的結合，其中Roxburic acid 與RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1具有更好的結合，Roxburic acid作為五環三萜類化合物[18]，目前還缺少對它的研究報告，分子對接的結果顯示，Roxburic acid在刺梨降血脂中可能發揮著重要的作用，還需我們進一步的研究與探索。

綜上所述，本研究通過構建高血脂大鼠模型，研究了刺梨對高血脂癥的治療作用，運用網絡藥理學分析和分子對接驗證，預測出刺梨治療高血脂癥的作用靶點和主要信號通路。其中關鍵作用靶點有RXRA、AKT1、ESR1、PIK3R1、PIK3CA、RXRG、RXRB、TNF等，關鍵通路主要涉及PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路、非酒精性脂肪肝疾病、MAPK信號通路、TNF信號通路等。刺梨對高血脂癥具有很好的治療作用，同時通過影響著多靶點、多個相關通路來發揮降低血脂的作用，這也為我們后續的作用機制進一步探索提供一定的參考。