參地顆粒對膜性腎病大鼠腎臟內質網應激及足細胞自噬的干預作用

魏 玲，金 華，王億平

(安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腎內科，安徽 合肥 230031)

膜性腎病是一組由免疫復合物介導的足細胞病變，臨床表現為大量蛋白尿，為腎病綜合征常見的病理類型之一[1]。膜性腎病傳統(tǒng)治療為激素聯(lián)合免疫抑制劑，但部分患者出現感染、股骨頭壞死、肝腎毒性、腫瘤等嚴重不良反應[2]，且病情不易控制或反復，最終進展至終末期腎病，對患者生活質量造成嚴重影響。探索膜性腎病的發(fā)病機制和治療方法已成為臨床研究的重點。近年來研究發(fā)現，持續(xù)的內質網應激是足細胞損傷的重要因素，而自噬對內質網應激介導的足細胞損傷具有保護作用，該機制有望成為防治足細胞病變的重要途徑[3-4]。中醫(yī)藥治療膜性腎病體現出一定的優(yōu)勢，既往研究[5-6]證實參地顆粒在治療腎小球疾病中已取得顯著療效，并有研究[7]表明參地顆粒可有效調節(jié)自噬的活性。大鼠尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白(cationic bovine serum albumin，C-BSA)是制作膜性腎病的經典模型。本研究將進一步觀察參地顆粒對C-BSA致腎病大鼠腎臟內質網應激及足細胞自噬的干預作用，從而探討其治療膜性腎病的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 2月齡清潔級雄性SD大鼠40只，體質量(200±20)g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心[動物生產許可號：SCXK(魯)2019-0003]，適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 實驗藥物與試劑 參地顆粒(皖藥制字BZ20080025，由人參、熟地黃、茯苓、五味子、桑螵蛸、雞內金、川芎組成，顆粒劑每袋10 g，含生藥34 g)：安徽省中醫(yī)院制劑中心研制。纈沙坦膠囊(國藥準字H20040217，每片80 mg)：北京諾華制藥有限公司。C-BSA(批號725M036)：北京索萊寶科技有限公司。弗氏不完全佐劑(F5506，批號SLBL9742V)：Sigma公司。尿蛋白濃度測定試劑盒(批號20201204)：南京建成公司。

2 方法

2.1 模型復制及分組 采用單純隨機抽樣法將40只大鼠隨機分為正常組、模型組、參地顆粒組、纈沙坦組，每組10只。除正常組外，其余30只大鼠均采用尾靜脈注射C-BSA建立膜性腎病模型[8]。預免疫：取C-BSA 100 mg溶解于生理鹽水15 mL中，與等量不完全弗氏佐劑混合，充分乳化。每只大鼠取混合液1 mL，在雙側腋下、腹股溝作多點皮下注射，隔日1次，共3次。正式免疫：按照16 mg/kg尾靜脈注射C-BSA，每周3次，連續(xù)4周。用代謝籠中收集的大鼠24 h尿液進行尿蛋白檢測，24 h尿蛋白(24-hour urine protein,24hUPro)量≥20 mg視為模型復制成功，<20 mg者予以剔除。正常組大鼠以相同的注射方式注射等容積生理鹽水。

2.2 給藥方法 正常組、模型組每日均給予10 mL/kg 生理鹽水灌胃；參地顆粒組每日給予4.0 g/kg參地顆粒水溶液灌胃，灌胃方法和劑量參照《中藥藥理研究方法學》相關章節(jié)[9]計算得出；纈沙坦組每日給予20 mg/kg纈沙坦膠囊混懸液灌胃。每日1次，每次3 mL，連續(xù)給藥8周。

2.3 標本采集及檢測方法 給藥8周后，用代謝籠收集大鼠24 h尿液，采用比色法測定尿蛋白濃度(24hUPro量=尿蛋白濃度×24 h尿量)。再用2%的戊巴比妥麻醉大鼠，摘取右側腎臟放入凍存管內，投放到液氮中，再轉入-80 ℃超低溫冰箱保存，以備Western blot檢測。

Western blot檢測方法：取100 mg腎組織加入1 mL組織裂解液及蛋白酶抑制劑制備組織勻漿，10 000 r/min離心40 min，收集上清液，提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白含量。100 ℃變性10 min，每組取等量蛋白質經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移到PVDF膜上。10%脫脂奶粉-TBST溶液室溫封閉4 h后，置入加有一抗[一抗稀釋比例：葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、人內質網應激相關蛋白(human endoplasmic reticulum stress-related protein，CHOP)為1∶500；Nephrin、Podocalyxin、微管相關蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3，LC3)、Beclin1為1∶1 000；β-actin為1∶1 000]的10%奶粉-TBST，4 ℃冰箱孵育過夜；次日用TBST漂洗后加入HRP標記的二抗(稀釋比例為1∶1 000)，室溫孵育2 h；TBST漂洗，加入增強型化學發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)后曝光；用Fluors凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶，蛋白的相對表達水平以目的蛋白光密度與β-actin條帶光密度的比值表示。

3 結果

3.1 各組大鼠一般狀況 正常組大鼠活動正常，反應靈敏，毛色光亮，飲食正常，體質量增加；模型組大鼠精神和毛發(fā)光澤度均較差，毛發(fā)脫落，攝食減少，尿量增多，大便稀，部分大鼠出現腹部皮下水腫。參地顆粒和纈沙坦組大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)、飲食、二便等情況均有改善。模型復制期間，有10只大鼠死亡，其中2只為C-BSA溶液過量所致，1只為尾靜脈注射過程中當場死亡，4只為尾靜脈注射次數過多，愈合不良，感染死亡；另外3只在模型后期死亡，為個體體質較差不耐受所致。治療期間，有3只大鼠死亡，其中正常組死亡2只，為灌胃不當，誤入氣管致死；模型組大鼠死亡1只，原因不明。

3.2 各組大鼠24hUpro含量比較 模型組大鼠24hUPro含量顯著高于正常組(P<0.05)。與模型組比較，參地顆粒組和纈沙坦組大鼠24hUPro含量顯著降低(P<0.05)，且參地顆粒組大鼠24hUPro含量顯著低于纈沙坦組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠24hUpro含量比較

3.3 各組大鼠腎臟中GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin、Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠腎組織中GRP78、CHOP、Beclin1蛋白相對表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均顯著升高，Nephrin、Podocalyxin蛋白相對表達水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，參地顆粒組和纈沙坦組大鼠腎組織中GRP78、CHOP表達水平均顯著降低，而Nephrin和Podocalyxin表達水平則顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，參地顆粒組Beclin1表達水平，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)，而纈沙坦組升高不顯著(P>0.05)；且參地顆粒組GRP78、CHOP表達水平均顯著低于纈沙坦組(P<0.05)，參地顆粒組Podocalyxin、Beclin1表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均顯著高于纈沙坦組(P<0.05)。見圖1、表2。

3.4 透射電子顯微鏡觀察腎小球變化 正常組大鼠的腎小球足細胞結構清楚，未見足突融合，基底膜均勻且未見增厚，上皮下未見電子致密物形成；足細胞內可見少量自噬小體形成。模型組大鼠的足突可見大部分融合或消失，基底膜彌漫性增厚，上皮下可見大塊電子致密物沉積；足細胞內自噬小體數量較正常組增多。參地顆粒組和纈沙坦組大鼠的腎小球足突融合程度較模型組減輕，基底膜輕度增厚，伴有少量電子致密物沉積；參地顆粒組大鼠的足細胞內自噬小體數量與模型組比較明顯增多，而纈沙坦組大鼠的足細胞內自噬小體數量與模型組大致相當。見圖2。

注：A.正常組；B.模型組；C.參地顆粒組；D.纈沙坦組

表2 各組大鼠腎臟GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin、Beclin1、LC3-Ⅱ/L3-Ⅰ蛋白表達水平比較

注：A.正常組；B.模型組；C.纈沙坦組；D.參地顆粒組；紅色箭頭示自噬小體

4 討論

膜性腎病發(fā)病的核心環(huán)節(jié)是足細胞的病變[10]。足細胞是一種位于腎小球基底膜外側的終末分化細胞，而足細胞及相鄰足細胞足突之間的裂孔膜構成蛋白等濾過的最后一道屏障。足細胞缺乏再生能力，因此足細胞的損傷或凋亡是導致腎小球疾病進展直至走向終末期腎病的主要原因。內質網是一種維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定的細胞器，在缺血、低氧、氧化應激等應激狀態(tài)下，內質網環(huán)境被破壞，從而導致未折疊蛋白的積累，稱為內質網應激[11]。足細胞含有豐富的內質網系統(tǒng)，內質網應激是膜性腎病重要的發(fā)生機制之一，適度的內質網應激是細胞應對外界刺激的保護機制，但發(fā)生在腎組織內持續(xù)或過強的應激反應是誘導足細胞損傷或凋亡的機制之一[3]。在這種病理環(huán)境中，細胞通常通過形成自噬體清除受損蛋白及細胞器來進行損傷修復[12]。與腎臟其他固有細胞相比，足細胞可維持較高自噬活性[13]，因此,足細胞損傷與自噬能力下降密切相關。在內質網應激條件下，當足細胞受到損傷時會即刻啟動自噬功能，以減輕內質網應激對足細胞造成的損傷，維持足細胞正常的結構和功能[3]。

GRP78、CHOP是內質網應激的關鍵因子。GRP78是一種位于內質網中的葡萄糖調節(jié)蛋白，參與蛋白質在內質網中的糖基化修飾，在發(fā)生內質網應激時明顯增多，故可作為內質網應激的標志性蛋白[14]，其表達水平反映了細胞應激的嚴重程度。CHOP是內質網應激信號通路下游重要的促凋亡因子，在內質網應激誘導的細胞凋亡和細胞損傷中具有重要作用，是內質網應激誘導多種細胞產生調亡的關鍵信號分子[15]。內質網應激誘導細胞凋亡通路可以增加CHOP基因的表達水平。本研究發(fā)現，作為膜性腎病的經典動物模型，C-BSA大鼠腎組織中GRP78、CHOP蛋白表達水平上升，而足細胞標志蛋白Nephrin、Podocalyxin表達水平降低，提示C-BSA大鼠出現內質網應激及足細胞損傷。

LC3是自噬的重要標志，當自噬發(fā)生時，LC3從Ⅰ型(LC3-Ⅰ)轉換為Ⅱ型(LC3-Ⅱ)[16]，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可以作為鑒定自噬活性的指標。Beclin1是自噬起始的重要調節(jié)因子，其表達水平可直接反映自噬活性[17]。本研究發(fā)現，C-BSA大鼠腎組織中Beclin1表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均顯著上升，提示自噬被激活，這可能為足細胞損傷后所誘導的保護性反應；增強自噬活性可減輕內質網應激及足細胞損傷，而抑制自噬活性可促進上述損傷效應。

近年來研究發(fā)現，中醫(yī)藥在調節(jié)免疫功能、減少免疫抑制劑所帶來的代謝紊亂和免疫力下降等方面有獨特的作用。膜性腎病是慢性腎炎的主要病理類型，其基本病機是脾腎虧虛、精微下注[18]。參地顆粒是根據清朝新安醫(yī)學名家程林所著《圣濟總錄纂要·卷十三·虛勞門》中的人參湯化裁而成，功效為健脾益腎、固攝精微。前期研究[19]顯示，該方能夠通過降低炎癥因子釋放和抑制炎癥反應，具有改善慢性腎炎患者的臨床癥狀，減輕蛋白尿等作用。且近期研究[19-20]已證實其對慢性腎炎患者和模型大鼠的免疫功能紊亂具有一定調節(jié)作用。血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑是目前治療膜性腎病蛋白尿的主要藥物。現代藥理學研究[21]發(fā)現，纈沙坦是一種細胞周期性藥物，能抑制細胞增殖活性，對抗原敏感性小淋巴細胞發(fā)揮非特異性殺傷作用，能改善腎小球內毛細血管濾孔狀況，從而減少蛋白排出，發(fā)揮腎臟保護作用。故本研究采用纈沙坦作為陽性對照藥物。

本研究進一步發(fā)現，參地顆粒具有減輕C-BSA大鼠的足細胞損傷及蛋白尿作用，并且能夠增強自噬活性，抑制過度的內質網應激反應，進而發(fā)揮對足細胞的保護性作用。但是其具體作用機制仍有待于進一步研究。