豬瘟脾淋苗免疫仔豬9 d外周血細胞轉(zhuǎn)錄譜分析

包松英 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

豬瘟（Classical swine fever，CSF），原名豬霍亂，是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）感染引起的嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的動物疫病[1]。我國通過十年的豬瘟疫苗強制免疫與重點監(jiān)測，已在很大程度上控制了CSF的流行[2]。豬瘟脾淋苗具有免疫原性好、免疫效果確切的優(yōu)點，是養(yǎng)殖戶預(yù)防控制豬瘟的首選產(chǎn)品之一，其制作工藝為豬瘟兔化弱毒株接種健康家兔，產(chǎn)生定型熱后收獲病毒含量高的脾臟和淋巴結(jié)，研磨制備而成[3]。脾淋苗中脾淋組織液具有免疫增強作用，可以提高疫苗的免疫效果[4-5]。劉新平等[6]在PRRSV與CSFV共感染的豬場免疫豬瘟脾淋苗，發(fā)現(xiàn)其阻斷帶毒母豬將CSFV垂直傳播給仔豬的效果十分顯著。

RNA-seq技術(shù)隨著生物信息學(xué)工具以及新一代測序技術(shù)的進步而不斷發(fā)展，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究，其主要測序?qū)ο鬄榉蔷幋a小RNA、信使RNA和長鏈非編碼RNA等。RNA-Seq可以檢測生物樣本幾乎所有轉(zhuǎn)錄本的序列與表達信息，研究生命體某個過程的作用機理，重要基因的表達模式與調(diào)控機制，揭示信號網(wǎng)絡(luò)的改變，并可能識別新的重要基因[2,7]。目前，研究人員已采用RNA-seq技術(shù)針對CSFV感染豬或兔體后的作用機制開展了相關(guān)研究[8-9]。

筆者及合作團隊于2020年開展了豬瘟脾淋苗、脾淋組織免疫小豬3 d的外周血轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)無論是含毒的脾淋苗還是不含毒的脾淋組織，均可對小豬免疫功能起到調(diào)節(jié)作用。為了獲得脾淋苗免疫后不同時間點的轉(zhuǎn)錄譜[10-11]，本文進一步開展9 d的外周血轉(zhuǎn)錄譜分析，旨在為豬瘟脾淋苗免疫機理研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組30～32日齡健康小豬10頭，購自福州市永泰縣某豬場，經(jīng)篩查試驗豬滿足未免疫豬瘟疫苗且特定病原陰性以及豬瘟抗體陰性的要求。特定病原指：非洲豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬圓環(huán)病毒2型。

隨機將10頭小豬分為A、B兩組，每組5頭，其中A組免疫豬瘟脾淋苗1頭份/頭，B組免疫等量不含豬瘟病毒的大兔脾淋組織。豬瘟脾淋苗、不含豬瘟病毒的大兔脾淋組織由兆豐華生物科技（福州）有限公司制備。

1.2 試劑 總RNA提取試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒購自蘭博利德試劑有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司。

1.3 樣品采集 采集免疫后9 d的豬前腔靜脈血抗凝樣本，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序與分析 提取全血樣品的總RNA，檢測完整性和總量后，構(gòu)建合格文庫，以Illumina HiSeqTM2500測序。原始測序數(shù)據(jù)通過過濾、錯誤率與GC含量檢查后，獲得clean data。使用HISAT2 v2.0.5將數(shù)據(jù)與豬參考基因組進行比對，采用featureCounts進行基因表達水平定量，使用DESeq2軟件進行差異表達分析，其中P值＜0.05、|log2Fold-Change|≥0的基因為差異表達基因。以clusterProfiler軟件實現(xiàn)差異表達基因的GO富集分析與KEGG通路中差異表達基因的統(tǒng)計富集，使用GSEA分析工具對樣品功能注釋與富集分析。

1.5 RT-qPCR驗證 選擇3個基因，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系為：25 mM MgCl22 μL，GoScriptTMReverse Transcriptase 1 μL，GoScriptTM5×Reaction Buffer 4 μL，Recombinant RNasin○RRibonuclease Inhibitor 0.5 μL，Oligo(dT)15 Primer 1 μL，Random Primers 1 μL，PCR Nucleotide Mix 10 mM 1 μL，Nuclease-Free Water補足至20 μL。反應(yīng)條件為：42℃反應(yīng)15 min，72℃反應(yīng)15 min獲得cDNA，進行RT-qPCR檢測，引物見表1。

表1 引物序列

RT-qPCR反應(yīng)體系為：模板1.0 μL，正向引物、反向引物各0.4 μL，QPCR Mix 10 μL，ddH2O補足至20 μL。循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共45個循環(huán)。以2^ΔΔCT法計算差異表達水平，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得豬瘟脾淋苗組（A組）與脾淋組織對照組（B組）的原始數(shù)據(jù)，從表2可知，各樣本凈堿基數(shù)均超過6 GB，凈讀數(shù)的Q20百分比＞98%、Q30百分比＞95%，GC比例＞50%。將處理的數(shù)據(jù)比對至豬類參考基因組，總比對率＞96%，測序質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)分析。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量指標評估結(jié)果

2.2 差異表達基因篩選結(jié)果 免疫后9 d，豬瘟脾淋苗組（A組）與脾淋組織對照組（B組）相比，DEGs有17 382個，其中差異顯著的DEGs有605個，分別是294個上調(diào)表達基因，311個下調(diào)表達基因（P＜0.05）。前15個上調(diào)基因和下調(diào)基因柱狀圖見圖1。

圖1 免疫后9 d DEGs柱狀圖

2.3 GO功能富集分析 將DEGs進行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)（見圖2）：免疫后9 d，豬瘟脾淋苗組（A組）與脾淋組織對照組（B組）相比，富集的條目有1 044個，其中與生物過程（Biological process，BP）相關(guān)的有749個，酰胺生物合成過程（Amide biosynthetic process）、細胞酰胺代謝過程（Cellular amide metabolic process）、翻譯（Translation）等23個過程顯著富集（Q＜0.05）。與細胞組分（Cellular component，CC）相關(guān)的有145個，胞質(zhì)核糖體（Cytosolic ribosome）、核糖體亞基（Ribosomal subunit）、核糖體（Ribosome）等15個組分顯著富集（Q＜0.05）。與分子功能（Molecular function，MF）相關(guān)的有150個，核糖體結(jié)構(gòu)成分（Structural constituent of ribosome）、結(jié)構(gòu)分子 活 性 （Structural molecule activity）、RNA結(jié) 合（RNA binding）3個功能顯著富集（Q＜0.05）。

圖2 免疫后9 d GO富集結(jié)果

2.4 KEGG通路分析 分析DEGs在KEGG通路中的富集結(jié)果可知（見表3），免疫后9 d，富集的信號通路數(shù)量有263個，差異顯著的通路有10個（P＜0.05），包含核糖體（Ribosome）、生熱作用（Thermogenesis）、一磷酸腺苷活化蛋白激酶信號通路（AMPK signaling pathway）等。

表3 9 d KEGG通路分析結(jié)果

從圖3可見，核糖體信號通路極顯著富集，該通路涉及的31個DEGs均為上調(diào)表達，其中組成大亞基的20個核糖體蛋白L基因 （ribosomal protein l genes，rpl）上調(diào)表達，分別是：rpl12、rpl38、rpl19、r pl35、rpl32、rpl10a、rpl31、rpl30、rpl14、rpl6、rpl11、rpl34、rpl35a、rpl24、rpl23a、rpl21、uba52、mrpl34、rpl3、rpl36a；組成小亞基的11個核糖體蛋白基因（ribosomal proteins genes，rps）上調(diào)表達，分別是：r ps17、rps18、rps8、rps7、rps13、rps19、rps4x、rps15a、rpsa、rps12、rps6。

圖3 免疫后9d核糖體信號通路DEGs富集結(jié)果

2.5 RT-qPCR驗證 本文隨機選擇STAT1、RNF125、MAP3K7 3個差異表達基因進行RT-qPCR驗證，結(jié)果見圖4。RT-qPCR與RNA-seq測序數(shù)據(jù)一致，本次轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可靠。

圖4 3個基因RT-qPCR驗證結(jié)果

3 討 論

傳統(tǒng)的豬瘟脾淋苗安全、免疫效果好，具有刺激豬體產(chǎn)生非特異性免疫增強的作用，是被廣大養(yǎng)殖戶認可的優(yōu)質(zhì)疫苗。為了完善豬瘟脾淋苗免疫機制研究，筆者于2020年開展了豬瘟脾淋苗免疫小豬3 d的外周血轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)脾淋苗免疫組相 對 于 脾 淋 組 織 對 照 組，CXCL10、RSAD2、OAS1、OAS2、MX1、ISG15等基因顯著上調(diào)表達，提示脾淋苗可能在免疫早期刺激宿主先天性免疫反應(yīng)[10]。本研究進一步開展豬瘟脾淋苗免疫小豬9 d的外周血轉(zhuǎn)錄組分析，與免疫后3 d相比，脾淋苗相對于脾淋組織，免疫后9 d的DEGs明顯增多，由3 d的317個上升到605個；免疫后9 d富集的GO功能也大幅度增加，由3 d的668個上升到1 044個，3 d的GO功能條目主要集中在與細胞對病毒的防御等互作方面，而9 d富集的GO條目主要是酰胺代謝、翻譯、核糖體等；免疫后9 d，富集的KEGG信號通路數(shù)量有263個，相較于3 d的215個，也有所提升，3 d的DEGs富集的信號通路主要與免疫和抗炎相關(guān)，9 d的則主要富集在核糖體信號通路等。

核糖體由蛋白質(zhì)和RNA構(gòu)成，是機體蛋白質(zhì)生物合成的主要場所。核糖體蛋白（Ribosomal proteins）是核糖體的主要成分，在核糖體組裝和蛋白質(zhì)翻譯中發(fā)揮重要作用。近年來，研究人員還發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白在腫瘤發(fā)生、免疫信號傳導(dǎo)和發(fā)育等方面的功能[12]，如Provost等[13-14]證實rpl3、rpl6、rpl23a三種核糖體蛋白影響斑馬魚胰腺發(fā)育。本研究表明，免疫后9 d，豬瘟脾淋苗組（A組）與脾淋組織對照組（B組）相比，DEGs主要為rpl基因和rps基因，在GO功能中極顯著富集于翻譯過程，核糖體、核糖體亞基組分，在KEGG數(shù)據(jù)庫富集于核糖體信號通路，預(yù)示著在免疫后9 d，脾淋苗可激活外周血細胞核糖體等信號通路，促進蛋白質(zhì)生物合成。