MMR蛋白表達結合林奇綜合征腫瘤家族史在林奇綜合征相關子宮內膜癌篩查中的臨床應用

郄智萍 周潔 莊曉丹 杜日昌 劉建 李泛湘 張柳萍 劉貞 陳巖 胡紅波

林奇綜合征（Lynch syndrome，LS）是一種常染色體顯性遺傳性疾病，易發生惡性腫瘤，包括結直腸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、胃癌等。其中約50%的LS女性患者會最先發生子宮內膜癌，因此子宮內膜癌又被視為前哨癌[1]。研究顯示，林奇綜合征相關子宮內膜癌（Lynch syndrome associated endometrial cancer，LS-EC）患者在10年內發生第2次惡性腫瘤的風險約為25%，15年內約為50%[2]。開展對子宮內膜癌患者的篩查，有利于早期發現、早期干預林奇綜合征患者。目前我國尚未建立成熟的篩查手段和完善的基因檢測指南，對LS-EC患者基因診斷的研究也較少。通過對高風險人群進行篩查，既可預防患者再次發生其他LS相關腫瘤，也有利于家族中其他成員規避LS相關腫瘤的風險，盡早采取相應的預防性措施。本研究旨在探索錯配修復（Mismatch repair，MMR）蛋白表達結合患者LS相關腫瘤個人史或家族史在子宮內膜癌患者中初篩林奇綜合征的應用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究納入2019年1月～2020年12月在我院經病理學診斷確診為EC的147例患者。納入標準：①有病理學確診證據，患者病理組織標本均采用免疫組化（IHC）檢測MMR蛋白表達；②有詳細的FIGO分期、手術治療方案及輔助治療方案；③有完善的臨床資料，包括患者個人和家族有無LS相關腫瘤等信息。排除標準：①外院完成全子宮+雙附件切除手術治療患者；②臨床資料、病理資料不全患者；③術前行新輔助放、化療患者；④復發型EC患者；⑤未行子宮內膜癌分期手術治療患者。本課題已獲醫院倫理委員會通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 對147例確診為EC患者的病理切片進行MLH1/PMS2/MSH2/MSH6蛋白免疫組化檢測。將石蠟切片依次烘片、脫蠟、水化，在檸檬酸鹽緩沖液中微波處理10min，冷卻后沖洗，3%H2O2中室溫避光孵育10min；加入一抗室溫孵育2h；漂洗后加入二抗室溫孵育30min；滴加DAB，顯微鏡下觀察5min，蘇木精復染后流水沖洗30min，封片觀察。每張病理切片均由至少兩名高級職稱病理醫師閱片及判讀結果。當有MLH1、PMS2、MSH2、MSH6任一蛋白表達缺失即為MMR蛋白表達缺失（Deficiency-MMR，dMMR），若4個蛋白均表達陽性則為MMR蛋白表達陽性（Proficient-MMR，pMMR）。

1.2.2 LS相關腫瘤個人史或家族史 147例EC患者均有詳細的個人史和一級、二級親屬的LS相關腫瘤病史調查，包括結直腸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌等。患者根據MMR蛋白的免疫組化結果分為dMMR組與pMMR組。dMMR組均建議行胚系基因檢測，pMMR組有LS相關腫瘤個人史或家族史者亦建議行胚系基因檢測，如MMR蛋白表達陽性且無LS相關腫瘤個人史或家族史，考慮為散發性子宮內膜癌，不建議行基因檢測。

1.2.3 胚系基因檢測 本研究委托深圳華大臨床檢驗中心，利用二代測序技術（NGS）結合目標區域捕獲，對檢測者相關基因（EPCAM、MLH1、MSH6、PMS2、MSH2、STK11、TP53、PTEN、MUTYH、BRCA1、MLH3）外顯子及其鄰近20個堿基對內含子區變異進行分析。根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）的分類標準，將突變情況分為：致病性、疑似致病性、臨床意義不明、可能良性、良性。本研究將已知或疑似致病突變統稱為有害突變。

1.3 統計學方法 采用易侕統計學軟件對數據進行統計分析。以NGS結果為確診標準，比較IHC、LS相關腫瘤個人史或家族史在LS-EC初篩中的預測價值。采用受試者工作特性曲線（Receiver operator characteristic curve，ROC）綜合對比兩種篩查方法的準確性。ROC曲線下面積（Area under curve，AUC）用來綜合評價診斷的準確性。AUC＞0.5時，越接近1表明診斷的準確性越高，0.8＜AUC≤0.9表示有較高的診斷價值，AUC＞0.9表示有很高的診斷價值。

2 結果

2.1 一般資料 147例EC患者發病年齡為30～75歲，平均53.46歲；診斷為LS患者平均年齡為49.6歲。病理類型包括子宮內膜樣腺癌132例，漿液性癌4例，透明細胞癌2例，癌肉瘤1例，混合細胞腺癌7例，鱗狀細胞癌1例；按照2009年FIGO分期：Ⅰ期129例，Ⅱ期7例，Ⅲ期10例，Ⅳ期1例。

2.2 免疫組化檢查MMR蛋白表達結果 147例患者中46例（31.3%）患者為dMMR，101例（68.7%）患者為pMMR。46例dMMR患者的蛋白缺失表達情況：MLH1/PMS2聯合缺失32例（21.8%），MSH2/MSH6聯合缺失3例（2.0%），MSH6/MLH1/PMS2聯合缺失2例（1.4%），單獨MSH6蛋白缺失3例（2.0%），單獨MLH1蛋白缺失3例（2.0%），單獨PMS2蛋白缺失2例（1.4%），單獨MSH2蛋白缺失1例（0.7%）。

2.3 LS相關腫瘤個人史或家族史 147例患者中有14例存在LS相關腫瘤個人史或家族史，其中10例為dMMR，4例為pMMR。10例dMMR患者均行NGS檢測，其中7例確診為LS。4例pMMR患者中3例行NGS檢測，均無基因突變。

確診為LS-EC且個人史或家族史陽性的7例患者中，存在LS相關腫瘤家族史6例，LS相關腫瘤個人史1例。6例家族史陽性患者中一級親屬患病5例，一級親屬合并二級親屬患病1例。家族史陽性患病人數：同一家族4人患病和3人患病各1例，2人患病4例。LS相關腫瘤分別為消化道惡性腫瘤5例，乳腺惡性腫瘤2例。見表1。

表1 LS-EC個人史、家族史陽性患者資料

2.4 林奇胚系基因檢測結果 147例患者中43例行NGS檢測，10例患者有致病突變或疑似致病突變，確診為LS，LS-EC發生率為6.8%。突變基因分別為PMS2突變4例（9.3%），MSH2突變3例（7.0%），MSH6突變2例（4.7%），MLH1突變1例（2.3%）。已知致病突變6例，疑似致病突變4例。見表2。

按MMR蛋白表達情況送檢NGS結果：dMMR組46例，行NGS檢測40例，10例診斷為LS-EC；pMMR組101例，行NGS檢測3例，均無基因突變，為散發性子宮內膜癌。

表2 LS-EC患者錯配修復基因突變結果

2.5 不同篩查方法預測價值比較 147例患者中有LS相關腫瘤個人史或家族史患者14例，其中7例確診為LS，敏感度為70.0%，特異性為94.9%，預測LS的AUC為0.82（見圖1）；經IHC檢測確定dMMR 46例，其中送檢NGS 43例，最終10例確診為LS，敏感度為100%，特異性為73.7%，預測LS的AUC為0.87（見圖2）。LS相關腫瘤個人史或家族史聯合MSH2/MSH6缺失預測LS的敏感度為70.0%，特異性為94.9%，AUC為0.83（見圖3）。LS相關腫瘤個人史或家族史聯合PMS2/MLH1缺失預測LS的敏感度為100%，特異性為76.6%，AUC為0.95（見圖4）。

免疫組化檢測為dMMR預測LS的敏感度最高，達100%；LS相關腫瘤個人史或家族史預測LS的特異性達94.9%，LS相關腫瘤個人史或家族史聯合MSH2/MSH6缺失預測LS的特異性也達94.9%；LS相關腫瘤個人史或家族史聯合PMS2/MLH1缺失預測LS的AUC最高，達0.95。

圖1 LS相關腫瘤個人史或家族史預測LS

圖2 dMMR預測LS

圖3 LS相關腫瘤個人史或家族史聯合MSH2/MSH6缺失預測LS

圖4 LS相關腫瘤個人史或家族史聯合PMS2/MLH1缺失預測LS

3 討論

文獻報道EC患者MMR基因突變率約為5.9%[3]。本研究147例EC患者中有43例行NGS檢測，最終10例患者診斷為LS，LS-EC發生率為6.8%，略高于文獻數據，考慮到本研究有6例dMMR患者未同意檢測胚系突變，我們預測實際LS-EC發生率可能更高。國內LS相關子宮內膜癌篩查并未普及，我國人群中LS-EC患者的實際比例可能更高。研究顯示，LS-EC患者的發病年齡普遍低于散發性EC患者[4]，發病年齡為46～54歲，小于50歲者占60%[5]。本研究中EC患者平均患病年齡為53.46歲，而10例診斷為LS患者平均患病年齡為49.6歲，低于散發性EC，與文獻報道一致。

有研究報道，EC患者MMR蛋白表達缺失率為29.89%[6]；晉薇等[7]報道420例EC患者中MMR蛋白表達缺失率為34.5%；本研究IHC篩查結果顯示dMMR發生率為31.3%（46/147），與相關文獻報道基本一致。本研究MMR蛋白表達缺失率最高的為MLH1/PMS2聯合缺失，發生率為21.8%（32/147）。MMR蛋白配對形成異二聚體，MLH1與PMS2配對，MSH2與MSH6配對，這些蛋白在不配對狀態下是不穩定的，MLH1和MSH2可以與其他蛋白形成穩定的異二聚體，而PMS2和MSH6只能分別與MLH1和MSH2形成異二聚體[8]。當出現基因突變時，可能引起該基因對應的蛋白表達缺失，也可能出現配對基因的蛋白表達缺失。如MLH1突變可導致MLH1和PMS2的聯合蛋白表達缺失，MSH2突變可導致MSH2和MSH6的聯合蛋白表達缺失。但MSH6突變一般只引起對應的MSH6蛋白表達缺失，PMS2突變一般只引起對應的PMS2蛋白表達缺失。

EC患者MMR基因突變率最高的是MSH2基因，突變率為50%～66%，其次是MLH1（24%～40%）、MSH6（10%～13%），PMS2突變率最低（＜5%）[9]。本研究與文獻報道不一致，10例LS基因突變率最高的是PMS2基因，4例PMS2突變有3例為疑似致病突變。相關研究報道，PMS2突變的EC患者中有27%被診斷為乳腺癌[10]。本研究中1例PMS2突變患者有姐姐及妹妹患乳腺癌家族史，故要關注PMS2基因突變患者繼發第二種LS相關腫瘤的風險，尤其要重視乳腺癌篩查。

本研究中基因突變率居第二位的是MSH2，3例MSH2基因突變中有2例存在消化道惡性腫瘤家族史。其中1例患者發現子宮內膜癌時年齡30歲，且術前同時診斷結腸癌，其母親在45歲和50歲時分別患子宮內膜癌和結腸癌。另1例患者35歲時發生子宮內膜癌，姐姐45歲時發生子宮內膜不典型增生，隨后患直腸癌，家族中尚有2名二級親屬患結直腸癌。這兩例MSH2基因突變患者的臨床特點為：先證者發生LS相關腫瘤的年齡較小，分別為35歲和30歲；家族中有至少2人以上患病；LS相關腫瘤以子宮內膜癌和結直腸癌為主，先證者的首發腫瘤均為子宮內膜癌。這提示我們需高度重視年輕子宮內膜癌患者的遺傳篩查，50%的情況下子宮內膜癌在結直腸癌診斷之前出現[1]，子宮內膜癌可作為患者自身和潛在家庭成員的前哨癌癥，且為家族成員提供充足時間來篩查和預防LS相關的第二種腫瘤。對MSH2基因突變的患者應加強一級親屬的突變位點測序，繪制家系圖，做好LS家系的長期風險管控和隨訪。

目前進行LS篩查的方法尚無統一定論。IHC檢測快捷、價廉、相對可靠，是目前廣泛接受的LS篩查方法。本研究中應用免疫組化檢測出46例MMR蛋白表達缺失，最終確診為LS-EC的10例患者均有MMR蛋白表達缺失，免疫組化檢測的敏感度達100%，但特異性僅為73.7%。有LS相關腫瘤個人史或家族史患者14例，其中7例確診為LS，特異性為94.9%。10例LS患者中有3例無家族史，因得益于免疫組化檢測出dMMR進而行NGS檢測篩查出LS，就篩查的敏感度而言，推薦MMR蛋白IHC檢測作為LS的初篩手段。30例未診斷為LS的dMMR患者中有27例無家族史，NGS檢測均無基因突變，提示臨床篩查出dMMR患者時，臨床醫師應詳盡地采集腫瘤家族史和個人史，并以LS相關腫瘤個人史或家族史作為分流手段，以提高篩查特異性。由于MMR蛋白表達缺失以MLH1/PMS2聯合缺失發生率最高，LS相關腫瘤個人史或家族史聯合PMS2/MLH1缺失預測LS的AUC為0.95，進一步證實聯合篩查的預測效能最高。

綜上所述，考慮篩查手段的可及性和成本效益，以IHC作為初篩手段，在dMMR人群中以個人史或家族史進行分流，可提高篩查特異性。MMR蛋白免疫組化檢測聯合LS相關腫瘤個人史或家族史是臨床LS篩查的最優策略。