中性粒細胞胞外誘捕網在新生兒膿毒癥肝損傷中的作用機制研究

肖海平 朱志偉

新生兒膿毒癥是臨床早產兒出現死亡及并發癥的主要原因之一，足月新生兒膿毒癥發病率相對較低，但仍有較高的嚴重不良結局風險。相關研究認為，膿毒癥在第三階段（膿毒性休克期）患兒已經出現明顯低血壓所致的灌注異常，此時患兒死亡率達30%～50%[1]，預后較差。由于膿毒癥可誘發全身免疫應答，炎癥反應的過激表達使血清中中性粒細胞數量急劇增加，中性粒細胞發揮免疫作用的機制包括直接胞內吞噬、脫顆粒作用后啟動非氧殺菌和釋放中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）[2]。有學者證明，NETs作為一種組蛋白和抗菌蛋白修飾的網狀DNA結構，在病原微生物控制播散及清除中有重要作用[3]，但過量的NETs會誘發炎癥瀑布反應導致吞噬細胞功能下降，加重炎性損傷，繼而使膿毒癥患者出現肝損傷[4]，本研究旨在探討膿毒癥并發肝損傷患兒NETs濃度特點，借此評估NETs在疾病發展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料 依據病例對照研究方式，收集2019年10月～2021年6月于我院診斷為膿毒癥的新生兒25例為觀察1組，25例膿毒癥并肝損傷新生兒為觀察2組，同期入院檢查的53例健康新生兒為對照組。入院后丙氨酸氨基轉移酶（ALT）升高至正常范圍高值2倍以上，天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（TBil）或堿性磷酸酶中至少一項升高幅度超過正常值2倍判定為肝損傷。單純膿毒癥患兒及合并肝損傷患兒均有不同程度體溫改變、心率增快、呼吸頻率改變等，均有喂養反應異常及活力異常。三組新生兒性別、受檢時日齡、出生時體重、分娩方式比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有良好的均衡可比性;觀察1組和觀察2組在膿毒癥誘發因素、母親合并病毒性肝炎、感染病原菌方面比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

續表1

1.2 納入標準 ①經血培養結果確認為膿毒癥；②日齡＜60天；③對照組均無任何病史；④患兒家屬知情同意；⑤經醫學倫理委員會批準。

1.3 排除標準 ①母親攜帶人免疫缺陷病毒或合并獲得性免疫缺陷綜合征；②因其他疾病導致的肝損傷；③藥物性肝損傷；④原發性膽道疾?。虎菹忍煨愿闻K發育障礙。

1.4 方法 統一條件下采集所有新生兒空腹靜脈血，以全自動生化分析儀檢測ALT及TBil。外周血NETs定量檢測以NETs組成結構中主要成分-雙鏈DNA（dsDNA）濃度作為NETs濃度，取4ml外周靜脈血于EDTA抗凝管，應用PicoGreen熒光染料進行dsDNA的定量檢測。

NETs激發時間測定：先分離中性粒細胞，采集10ml外周靜脈血，離心管內準備5ml中性粒細胞分離液，取5ml血液疊加于分離液表面，離心40min；將管內粒細胞層收集完全后置入M199培養基中，在細胞滲透壓恢復后進行離心，去除上清液，M199培養基（5ml）重懸進行細胞沉淀，后離心5min；棄上清液，添加紅細胞裂解液后放于冰上裂解10min，離心；再次棄上清液，用M199培養基重懸，混勻后離心；棄上清液，細胞沉淀仍用培養基重懸；以臺盼藍進行染色，取純化中性粒細胞。通過外物刺激中性粒細胞，刺激物選擇乙酸肉豆蔻佛波醇或N-甲酰-L-甲硫酰胺-L-白氨酰-L-苯丙氨酸，用量以中性粒細胞產生NETs為宜，記錄NETs開始產生時間。

1.5 觀察指標 比較各組肝功能指標（ALT、TBil）及中性粒細胞相關參數（中性粒細胞計數、NETs）；根據《臨床兒科學》中關于兒童膿毒癥診斷與分期標準[5]，將膿毒癥新生兒分為膿毒癥、嚴重膿毒癥及膿毒性休克三組，并比較三組患兒的中性粒細胞計數及NETs；比較膿毒癥早產兒及足月兒的中性粒細胞相關參數。

1.6 統計學分析 數據均錄入SPSS 22.0軟件進行處理，不同組別肝功能指標及中性粒細胞參數比較采用重復測量數據方差分析，計量資料行t檢驗，計數資料行秩和檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 各組肝功能指標及中性粒細胞相關參數比較 觀察1組、2組患兒ALT、TBil及中性粒細胞計數、NETs濃度均明顯高于對照組，且觀察2組上述指標水平明顯高于觀察1組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.2 不同分期膿毒癥患兒中性粒細胞計數及NETs比較 膿毒性休克組及嚴重膿毒癥組患兒中性粒細胞計數、NETs濃度均顯著高于膿毒癥組，且膿毒性休克組上述指標水平顯著高于嚴重膿毒癥組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.3 不同胎齡膿毒癥患兒中性粒細胞相關參數比較 早產兒中性粒細胞計數及NETs濃度均低于足月兒，NETs形成時間長于足月兒，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表2 各組肝功能指標及中性粒細胞參數比較（±s）

表2 各組肝功能指標及中性粒細胞參數比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與觀察1組比較，bP＜0.05

組別 ALT（U/L）TBil（μmol/L）中性粒細胞計數（×109/L）NETs（%）觀察1組（n=25） 60.94±10.28a27.08±4.54a 19.67±4.67a39.87±4.15a觀察2組（n=25） 103.21±8.17ab65.27±3.71ab30.27±9.47ab44.64±4.78ab對照組（n=53） 52.34±8.63 18.41±3.28 7.31±1.08 0.98±0.07 F 281.377 1374.718 172.279 2293.012 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 不同分期膿毒癥患兒中性粒細胞計數及NETs比較（±s）

表3 不同分期膿毒癥患兒中性粒細胞計數及NETs比較（±s）

注：與膿毒癥組比較，aP＜0.05；與嚴重膿毒癥組比較，bP＜0.05

組別 中性粒細胞計數（×109/L） NETs（%）膿毒癥組（n=30） 50.17±10.71 38.78±4.57嚴重膿毒癥組（n=16） 57.28±10.28a 42.01±5.27a膿毒性休克組（n=4） 70.12±6.05ab 49.78±3.18ab F 7.729 10.445 P 0.001 0.000

表4 不同胎齡膿毒癥患兒中性粒細胞相關參數比較（±s）

表4 不同胎齡膿毒癥患兒中性粒細胞相關參數比較（±s）

組別 中性粒細胞計數（×109/L） NETs（%） NETs形成時間（h）早產兒（n=31） 21.09±7.51 30.61±4.85 4.43±1.02足月兒（n=19） 30.28±9.87 40.30±6.84 2.36±0.49 t 3.723 5.857 8.257 P 0.000 0.000 0.000

3 討論

3.1 新生兒膿毒癥可出現ALT及TBil水平異常升高 本研究中膿毒癥患兒ALT及TBil水平均高于健康新生兒（P＜0.05），初步提示無論是否明確合并肝損傷，膿毒癥患兒均可出現肝功能下降，合并肝損傷后肝臟功能減退更加明顯。從炎癥介質介導的肝微循環障礙及氧自由基過氧化導致的肝損傷角度分析原因：新生兒膿毒癥是指細菌或真菌在新生兒娩出前、娩出過程中或娩出后經各種途徑進入新生兒血液循環并在其中生長繁殖后造成的中毒反應，患兒機體中大量細菌代謝產物及內毒素釋放入血，機體對此作出的早期反應可能上升至炎癥介質瀑布狀態，各類炎性介質短時間內分泌增加且氧自由基水平增高，而肝臟參與人體解毒及免疫防御，內毒素、代謝產物、炎性因子、氧自由基等大量積聚于肝臟引起肝細胞損傷，因此膿毒癥后肝臟是最易受累的器官之一。在嚴重肝損傷期，中性粒細胞被招募到病灶區的情況減少，反而會誘發非感染部位的組織損傷，繼而導致多個臟器功能受損；在肝損傷后進一步干擾膽汁代謝進程，中性粒細胞分泌的NETs抑制膿毒癥期的淋巴細胞計數，機體往往存在免疫功能障礙，致使TBil水平增高，因此，肝損傷后可出現ALT增高，膽汁代謝障礙后則可出現TBil濃度增高，前者能反映肝細胞損傷程度，后者能較好地反映肝功能減退程度，評估肝功能指標可以初步判斷患兒預后。另有研究針對成年膿毒癥患者進行死亡風險因素分析，認為膿毒癥并發肝損傷是膿毒癥患者死亡的獨立風險因素[6]，亦證實本研究結果的可靠性。

3.2 膿毒癥患兒中性粒細胞計數及NETs變化的臨床意義 本研究顯示觀察1組、2組患兒中性粒細胞計數、NETs濃度均明顯高于對照組，不同膿毒癥分期患兒的中性粒細胞計數、NETs水平差異顯著，以膿毒性休克患兒的癥狀最為嚴重（P＜0.05），提示感染發生后患兒免疫系統激發了大量的中性粒細胞。結合中性粒細胞NETs的生理作用分析其表達水平對膿毒癥肝損傷的可能影響機制：①中性粒細胞是人體與生俱來的第一道免疫防線，具有強大的吞噬能力及趨化作用，在機體以各類炎性細胞激活對膿毒癥發出免疫防御反應中扮演重要角色，但在膿毒癥時期，中性粒細胞的募集反而會造成肝損傷及膽汁淤積，本研究中患兒的ALT水平及TBil濃度異常升高。同時淋巴細胞是患兒機體適應性免疫的主要部分，其分泌水平與皮質醇、神經內分泌應激有關，因此中性粒細胞的變化往往反映不受抑制的炎癥反應，加重膿毒癥，同時也代表潛在的免疫途徑。②中性粒細胞免疫作用中除直接吞噬外，在炎性介質、應激等作用下中性粒細胞可發生NETosis凋亡方式，核膜、胞質顆粒膜均發生溶解，導致染色質、胞漿顆粒產生接觸并在胞膜破裂后排放至細胞外，這種向細胞外釋放的纖維網狀結構物質為NETs。組蛋白、中性粒細胞源性循環DNA、蛋白酶顆粒（如乳鐵蛋白、髓過氧化物酶、溶菌酶等）組成該結構框架，NETs能捕捉并殺滅病原菌，構成中性粒細胞另一重要的抗感染方式。膿毒癥患兒感染部位召集了大量中性粒細胞，NETs以物理黏附方式聚集于病原微生物周圍，限制病原體擴散后暴露于抗菌藥物作用范圍內，增強藥物治療效果[7]；其次NETs成分組成結構中包含的抗菌蛋白能直接殺滅病原體，如組蛋白是NETs結構中含量最高的蛋白，其殺菌能力是其他同等劑量殺菌劑的100倍[8]，髓過氧化物酶對次氯酸的形成有催化作用，高水平次氯酸可清除病原菌，乳鐵蛋白能隔離病原微生物繁殖所需的離子基團，進而限制其生長，因此較高水平的NETs有利于膿毒癥感染控制[9]。通過檢測外周血NETs表達水平亦可作為膿毒癥嚴重程度的評估指標之一。③研究表明[10]，NETs存在一定細胞毒性作用，盡管NETs結構中的組蛋白、髓過氧化物酶、絲氨酸蛋白酶等對病原體有殺滅效果，但對正常細胞亦有影響，如組蛋白對細胞有毒性，絲氨酸蛋白酶能分解正常細胞外基質蛋白后損傷組織，髓過氧化物酶催化形成的次氯酸則能損害細胞膜完整性；而且NETs在肝臟的肝竇位置能固定存活24h左右[11]，致使局部損傷集中，肝臟細胞毒性損害愈加明顯。本研究中觀察2組患兒NETs水平高于其他兩組，因此NETs對于膿毒癥患兒而言具有雙重作用。有研究發現，NETs能加速凝血進程，血小板聚集后血栓形成風險增加，降低微血管灌注后引起血管內皮損傷，聯合NETs毒性作用共同引起患兒上皮細胞、內皮細胞等損害與死亡，加重患兒病情[12]。提示在新生兒膿毒癥治療中應注意NETs濃度改變，及時檢測各器官功能狀態，在恰當時機予以干預，既保留NETs清除病原菌的能力，又能控制其對正常組織的侵害深度。

3.3 中性粒細胞相關參數對早產的影響 本研究結果顯示早產膿毒癥患兒NETs形成時間明顯長于足月患兒且NETs濃度低于足月患兒，表明發生感染的新生兒胎齡越小，NETs產生越延遲，且水平越低，分析原因可能與早產兒中性粒細胞、NETs調節機制尚不成熟有關。早產兒NETs形成延遲意味著中性粒細胞整體殺菌能力低下，而中性粒細胞作為新生兒時期最主要的免疫細胞不能有效發揮作用后，對患兒感染控制及預后極其不利。高雪鋒等[13]認為新生兒中性粒細胞數量雖多但NETs形成能力較低，致使胞內殺菌能力正常但胞外殺菌能力較弱，導致中性粒細胞整體殺菌能力低于正常成年人。另有研究顯示足月新生兒的中性粒細胞在接受脂多糖刺激后2h產生少量NETs，早產兒則完全不能形成[14]，均表明了不同胎齡新生兒產生NETs能力的差異。因此針對膿毒癥早產新生兒應及時干預、促進活化進程[15]。

綜上所述，膿毒癥肝損傷新生兒中性粒細胞水平可出現明顯升高，NETs濃度亦明顯增高，早產兒NETs形成時間較晚。NETs濃度的變化一方面表明該物質參與感染控制，一方面提示對機體正常細胞損害加重，可疊加肝臟損傷危險。