一株異養硝化-好氧反硝化菌株的分離鑒定及其對養殖廢水的脫氮效果

陳春秀，馬 超，劉 皓，王群山，賈 磊，于燕光，殷小亞，錢 紅

(1.天津市水產研究所，天津300221；2.天津市農業發展服務中心，天津 300201 )

近年來，隨著我國海水養殖業向集約化現代化的高速發展，產生了大量的養殖廢水，同時也帶來了嚴重的環境污染及生態安全等問題。由于水產養殖動物的殘料、排泄物、尸體等有機物導致養殖廢水中含有大量含氮化合物，不僅危害養殖動物，損害養殖者的經濟效益，還會對我們賴以生存的環境及水生態系統造成嚴重影響及危害，從而制約了我國海水養殖的健康可持續發展。因此，海水養殖廢水的凈化處理已成為養殖業亟待解決的關鍵問題。生物脫氮因其經濟高效、綠色環保等優點被廣泛關注，并應用于養殖廢水處理，其中異養硝化-好氧反硝化細菌相比于傳統脫氮，不受限于氧氣，而且能將氨氮直接轉化為氮的氣態產物而備受關注，近年來一直是學者研究的熱點。

1983年Robertson首次發現并提出異養硝化-好氧反硝化細菌概念，其后不同菌屬的異養硝化-好氧反硝化菌被相繼從不同環境中分離并鑒定，包括不動桿菌、假單胞菌、黏質沙雷氏菌等。目前，關于異養硝化-好氧反硝化細菌在水產養殖廢水處理實際應用方面鮮有報道的研究，大多處于實驗室階段。孫雪梅等從海水中分離出一株異養硝化-好氧反硝化菌2-3屬于鹽單胞菌() ，在高鹽環境中生長，同時具有高效的異養硝化和好氧反硝化能力，能夠獨立完成脫氮的全部過程。張達娟等從凡納濱對蝦養殖池塘中分離出來的一株施氏假單胞菌()，通過凈化模擬養殖水體結果表明此菌株脫氮效果明顯。脫氮細菌在水產養殖業上的應用越來越廣泛，而異養硝化-好氧反硝化細菌也勢必會給規模集約化水產養殖廢水處理帶來新的希望。因此，篩選出適應有氧高鹽水環境，且能高效脫氮的菌株，是海水養殖廢水凈化的關鍵。不僅有利于揭示異養硝化-好氧反硝化細菌脫氮機理，還可以為海水養殖廢水凈化處理等工藝提供菌種。本研究從海水養殖廢水處理池中經分離篩選得到1株異養硝化-好氧反硝化菌株，通過形態學和16S rDNA 基因序列分析對其進行了菌種鑒定，并將其接種到實際的半滑舌鰨工廠化養殖廢水中，對其實際應用處理效果進行了初步研究。以期對海水養殖廢水凈化及其相關微生態制劑開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 分別從天津市漢沽區對蝦育苗尾水沉淀池塘采集底泥和海水養殖廢水處理池中生物填料采集生物膜，用于分離篩選細菌。

1.1.2 培養基及溶液

溴甲基酚藍(BTB)固體培養基：檸檬酸鈉5.0 g，KNO1 g，KHPO1.5 g，KHPO1.5 g，BTB 1mL，MgSO·7HO 0.2 g，鹽度為15 ‰的人工海水， BTB 1 mL，瓊脂25.0 g，用NaOH調pH值至7.0～7.3。該培養基用于菌株分離和初篩。

異養硝化培養基：NHCl 0.5 g；檸檬酸鈉5.66 g；維氏鹽溶液50 mL；調pH至7.0。該培養基用于初篩菌株氨氮去除能力測試。

維氏鹽溶液：KHPO5.0 g；MgSO·7HO 2.5 g；FeSO·7HO 0.05 g；MnSO·4HO 0.05 g；鹽度為15‰的人工海水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 異養硝化-好氧反硝化菌分離純化 取水樣懸液10 mL用無菌水稀釋制備成10稀釋液，取0.1 mL涂布在BTB固體培養基上，28 ℃恒溫培養2～3 d，將能使BTB培養基由綠變藍的菌株在已制好的平板培養基上進行劃線分離純化，挑取不同類型的菌落分離純化3次以上，直至得到單一的菌落為止。鏡檢驗純并采用甘油保存法-80 ℃保種。

1.2.2 好氧反硝化菌株硝化能力的測定 無菌條件下，將分離純化的菌株分別接種至裝有100 mL液體異養硝化培養基的250 mL錐形瓶中富集培養，28 ℃，120 r/min培養24 h。再將富集后的菌懸液再次分別以1 %的接種量接種至分別裝有液體異養硝化培養基的錐形瓶中，于28 ℃恒溫，搖床培養24 h后，搖勻后移取10 mL菌液，以8 000 r/min離心，取上清液。檢測其中氨氮的濃度。根據氨氮和總氮的去除率，挑選一株高效的脫氮細菌。

1.2.3 菌種鑒定

形態學鑒定：將篩選的一株高效菌株接種于BTB固體培養基上，28 ℃恒溫培養24 h，待長出單個菌落后，進行形態學觀察、革蘭氏染色和電鏡掃描。

16S rDNA基因分子鑒定：采用蛋白酶K裂解的方法進行基因組DNA抽提，采用引物8F(5′ - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′ -GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進行 PCR 擴增。PCR 反應體系：BioLinker 2×Taq Mix 20 μL，上游引物8F和下游引物1492R各1 μL，模板1 μL，補ddHO至40 μL。PCR 程序：94 ℃，3 min ；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s ；72 ℃ 90 s；循環25次；72 ℃，5 min；10 ℃，5 min。高效菌株的擴增產物測序工作由上海微基生物科技有限公司完成，測序結果與NCBI數據庫進行同源性比對，并利用 MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹。

1.2.4 菌株WM2對養殖廢水脫氮效果研究 試驗所用水樣采集自天津漢沽水產養殖廢水處理池。經檢測，該廢水中氨氮濃度為(0.83±0.04)mg/L，硝態氮(0.19±0.02)mg/L，亞硝態氮(0.87±0.05)mg/L。

將養殖廢水抽濾后分裝到3個250 mL錐形瓶中(三個平行)，按1%接種量介入菌株WM2懸液，接種后將水樣至于28 ℃，120 r/min培養箱中48 h，每24 h取50 mL水樣測定氨氮、硝態氮、亞硝態氮濃度，測定方法參照海洋監測規范(GB 17378.4-2007)和《水和廢水監測分析方法》進行。

1.2.5 數據分析 試驗結果用平均值±標準差表示；在統計軟件SPSS 20.0中利用單因素方差分析對數據進行分析比較，顯著性差異水平參考<0.05。

2 結果與分析

2.1 分離純化和初篩菌株

利用BTB培養基的顯色反應，共分離純化篩選出5株具有反硝化能力的菌株。然后將5株菌株接入氨氮初始濃度為101 mg/L的異養硝化液體培養基中，培養24 h后檢測其中氨氮和總氮的濃度。結果表明(圖1)，5組液體培養基中的氨氮都有一定的降解，說明5株菌株均有一定的硝化能力，其中3號菌株處理的液體中氨氮和總氮去除率最高，分別為76.3%和53.5%，圖2的結果顯示3號菌株并沒有亞硝態氮的積累，因此將此菌株作為研究對象，并命名為WM2。

圖1 5株菌株在異養硝化液體培養基中培養24 h的總氮和氨氮去除率

圖2 5株菌株在異養硝化液體培養基中培養24 h后的亞硝態氮濃度

2.3 菌株鑒定

2.3.1 菌株形態特征 分離的菌株WM2在固體培養基平板上形成的菌落呈現圓形，略微凸起，顏色略黃且透明，邊緣規則整齊，表面光滑(圖3 a)。通過顯色反應表明該菌株為革蘭氏陰性菌(圖3 b)。經電鏡掃描發現，菌株WM2為短桿狀，無鞭毛(圖3 c)。

圖3 菌株WM2的形態特征

2.3.2 菌株16S rDNA基因序列和系統發育 通過擴增和測序，獲得菌株WM2的16S rDNA序列大小為1 393 BP，BLAST對比結果表明，菌株WM2與AR-11(GenBANk:NR_116301.1) 的相似度最高為99.282%，在比對結果中挑選與菌株WM2相似性最高的前10位物種構建系統發育樹(圖4)，結合菌株WM2的形態學，結果表明菌株WM2屬于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)海生桿菌屬()。

圖4 基于16S rDNA基因序列同源性構建的菌株WM2的系統發育樹

2.4 菌株WM2在海水養殖廢水中的脫氮效果

將篩選的菌株WM2應用于實際海水養殖廢水中，經菌株WM2處理后的養殖廢水中的氨氮、亞硝態氮和硝態氮濃度均有所下降(圖5)，其脫氮效果明顯，處理48 h后的氨氮、亞硝態氮和硝態氮去除率分別為99.66%、88.77%和89.38%(圖6)。

圖5 菌株WM2處理不同時間后養殖水體中的氨氮、亞硝態氮、硝態氮的濃度

圖6 菌株WM2處理不同時間后養殖水體中的氨氮、亞硝態氮、硝態氮的去除率

3 討論

海生桿菌屬屬于海洋螺菌目、海洋螺菌科，最早于1997年由González等發現并鑒定。到目前為止超過18種菌種從各種海洋環境中被分離，且均為革蘭氏陰性菌，細胞形態為桿狀，其中大多數菌種的最適生長溫度為30 ℃，pH為7～8。對于海生桿菌屬的研究多見于海洋芳香烴污染物治理，如Bae等從海洋沉積物中分離一株可以降解苯的海生桿菌菌株ST58-10T，王夢汝等在對海生桿菌屬基因組測序數據分析時發現，海生桿菌屬普遍具有苯、苯酚和苯甲酸的降解途徑。而對于海生桿菌屬在脫氮作用方面研究鮮有報道。目前應用異養硝化-好氧反硝化細菌對養殖廢水進行凈化處理的研究廣泛，陳猛等從豬糞水自然曝氣池中篩選出菌株ZF2-3，將其應用于養殖廢水脫氮結果表明，水體中氨氮、總氮濃度分別降低37.7%、67.4%；康傳磊等考察了3株異養硝化-好氧反硝化細菌對圓斑星鰈養殖廢水的凈化效果，研究表明添加的異養硝化-好氧反硝化細菌可在不添加碳源的情況下實現脫氮功能，有效維護養殖水質，并且對圓斑星鰈無毒害及致病作用。本研究從海水養殖廢水處理池中分離篩選的菌株WM2，通過形態學和16S rDNA基因序列分析表明該菌株屬于海生桿菌屬，且為一株異養硝化-好氧反硝化細菌，具有良好的脫氮性能，尤其是在高鹽有氧條件下的養殖廢水中脫氮效果顯著，普通微生物在高鹽度環境下因高滲透壓導致其細胞質壁分離抑制其酶活及生長，從而使常規生物處理效果不明顯，因此該菌株的發現對海水養殖廢水凈化具有重大意義，存在巨大開發和應用價值。

在本試驗初篩時，液體異養硝化培養基中氯化銨是唯一的氮源，菌株WM2表現出較強的氨氮去除效果，氨氮去除率達到76.3%，且幾乎沒有亞硝態氮和硝態氮的積累，具有異養硝化-好氧反硝化功能，同時WM2對總氮的去除率為76.3%，因此我們推斷部分氨氮被用于菌體細胞物質的合成，其余部分氨氮可能通過羥胺氧化途徑直接轉化為氣態排出反應體系；當用菌株WM2對實際養殖廢水進行凈化處理時，氮源變成氨氮、硝態氮、亞硝態氮的混合氮源，WM2的脫氮效果顯著，處理48 h后的氨氮去除率89.38%、硝態氮去除率88.77%、亞硝態氮去除率99.66%，但其具體脫氮機理還有待研究。碳源同樣是好氧反硝化菌脫氮效果主要影響因子之一，不僅為細菌進行生命活動提供能量，還能為其好氧反硝化過程提供電子受體，且有研究表明好氧反硝化菌主要以葡萄糖、丁二酸鈉、乙酸鈉和檸檬酸鈉等為碳源，少數也有以難降解的有機物為碳源，郭超等對一株從污泥中分離出的高效好氧反硝化菌株Y8進行不同碳源脫氮性能時發現丁二酸鈉為最佳碳源。除了碳源外，適宜的溫度、pH、碳氮比、菌種接種濃度都是異養硝化-好氧反硝化菌脫氮效果的影響因素，而本試驗對篩選菌株進行脫氮性能測試時所有培養基均以檸檬酸鈉作為唯一碳源且試驗條件較為單一，并沒有確定WM2最佳脫氮條件，下一步擬對其生理生化特性及脫氮機理進行研究。

4 結論

從對蝦育苗尾水沉淀池塘采集底泥和海水養殖廢水處理池中生物填料，利用BTB培養共分離純化篩選出5株具有反硝化能力的菌株。并利用異養硝化液體培養基測試這5株菌株的氨氮去除能力，其中3號菌株氨氮和總氮去除率最高，分別為76.3%和53.5%，并命名為WM2進行下一步研究。

通過形態學鑒定結果表明菌株WM2為革蘭氏陰性菌，電鏡掃描發現其為短桿狀，無鞭毛，菌落呈現圓形，略微凸起，顏色略黃且透明，邊緣規則整齊，表面光滑。16S rDNA序列大小為1 393 BP，與strain AR-11(GenBANk:NR_116301.1) 的相似度最高為99.282%。

菌株WM2對實際海水養殖廢水處理48 h后氨氮、亞硝態氮和硝態氮去除率分別為99.66%、88.77%和89.38%，其脫氮效果明顯。