魚類中低氧誘導(dǎo)因子表達及功能的研究進展

李 潤，王秀利

(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

氧氣是所有有氧生物進行生命活動所必需的，因此它也是魚類在生長發(fā)育和代謝過程中不可缺少的物質(zhì)。對于水生動物來說，缺氧的現(xiàn)象越來越容易發(fā)生，這也可能是近年來全球氣候變暖或水體富營養(yǎng)化等因素造成的結(jié)果。而在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)缺氧的現(xiàn)象更是頻頻出現(xiàn)，隨著目前水產(chǎn)養(yǎng)殖量的擴大，養(yǎng)殖過程中高密度養(yǎng)殖和氣溫升高都會造成水體缺氧，所以對低氧的研究也就顯得尤為重要。

異養(yǎng)生物的新陳代謝很大程度依賴于氧氣，而在低氧條件下，低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)是機體對氧氣濃度產(chǎn)生應(yīng)答等相關(guān)生理反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子。低氧誘導(dǎo)因子HIF作為異源二聚體，由與氧氣調(diào)節(jié)有關(guān)的α亞基和β亞基組成，因為α亞基這一功能單位的差異性，所以在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三種不同的HIF(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)，而在魚類研究中除了前三種還發(fā)現(xiàn)了第四種HIF(HIF-4)，且HIF-4α蛋白與HIF-3α蛋白的關(guān)系較為密切，但是HIF-3α與HIF-4α的研究還是較少，一直以來大部分研究都圍繞HIF-1α和HIF-2α展開。

低氧誘導(dǎo)因子HIF作為低氧條件下的重要調(diào)控因子，主要通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、內(nèi)皮素1(endothelin-1,ET-1)、促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)等基因的表達，來調(diào)節(jié)機體在低氧環(huán)境中的適應(yīng)性，因此HIF信號通路也成為低氧研究中的主要信號通路。而在低氧條件下參與調(diào)控的還有哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路(mammalian target of rapamycin,mTOR)和非折疊蛋白反應(yīng)途徑等，這些通路通過轉(zhuǎn)錄或抑制的方式來調(diào)節(jié)機體對氧氣的感受，而這些調(diào)控會直接涉及到機體的能量代謝、生長發(fā)育和細胞凋亡等，因此魚類對低氧條件產(chǎn)生應(yīng)答的分子機制是十分復(fù)雜的。本文通過對低氧誘導(dǎo)因子在魚類中的功能和表達進行綜述，為今后魚類低氧方面的研究提供思路。

1 HIF-1α和HIF-2α的結(jié)構(gòu)與功能

魚類中低氧誘導(dǎo)因子的結(jié)構(gòu)與功能和哺乳動物的類似，且哺乳動物中對低氧誘導(dǎo)因子的研究更為深入，所以這也為魚類低氧誘導(dǎo)因子的研究提供了參考。HIF-1α和HIF-2α的發(fā)現(xiàn)分別是Semenza等人在低氧條件下處理肝細胞癌株Hep3B和Tian等人在研究內(nèi)皮細胞時所發(fā)現(xiàn)。到目前為止研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在低氧條件下參與了150余種基因的表達與調(diào)控，如促紅細胞生成素基因、血管內(nèi)皮生長因子基因和糖酵解基因等，而HIF-2α的結(jié)構(gòu)與HIF-1α相似，功能上也具有相似性，所以這兩個蛋白的研究在魚類中也逐漸深入。現(xiàn)如今已在部分魚類中進行了-1α基因和-2α基因的克隆與表達，并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)對HIF通路的調(diào)控機制進行研究。

在低氧條件下HIF-1α?xí)诩毎酥斜磉_，而在常氧條件下，HIF-1α的天冬酰胺殘基會被天冬酰羥化酶(factor inhibiting HIF-1,FIH)羥化，并使HIF-1α不能與環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白結(jié)合(P300/CBP)導(dǎo)致失活；HIF-1α自身的氧氣依靠降解結(jié)構(gòu)域( oxygen-dependent degradation domain,ODDD)中的Pro402與Pro564作為特異性脯氨酸位點，被脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase,PHD)羥基化，之后與腫瘤抑制蛋白pVHL結(jié)合，pVHL與elongin B、elongin C、Rbx1、cullin-2組成了VCB-Cul2E3泛素連接酶復(fù)合體，然后使HIF-1α降解，這兩種途徑使魚類在低氧條件下PHDs和FIH失活，導(dǎo)致HIF-1α蛋白的增多，促進了相關(guān)低氧基因的轉(zhuǎn)錄，在細胞的增殖和代謝等方面發(fā)揮了作用，如圖1所示。HIF-2α和HIF-1α通過相同的途徑降解，不同的是HIF-2α蛋白在N端和C端分別有一個與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和具有轉(zhuǎn)錄激活作用的反式活化結(jié)構(gòu)域。

圖1 HIF1的激活與調(diào)控

雖然HIF-1α和HIF-2α結(jié)構(gòu)功能有相似性，但它們卻不能直接互相代替，例如CAR9( carbonic anhydrase 9)、LDHA( lactate dehydrogenaseA)等基因只能被HIF-1α激活，同樣，SOX2[SRY ( sex determining region Y)-box2]等只能被HIF-2α激活。而且HIF-1α?xí)诖蠖鄶?shù)動物的組織器官細胞中表達，而HIF-2α在常氧條件下發(fā)現(xiàn)不了表達情況，只有在低氧條件下HIF-2α的表達才會增加，它們之間雖功能相似，但又相互獨立，在不同細胞之間的表達差異機制也存在不確定性。因此，它們之間調(diào)控表達的關(guān)系也一直在被研究。

2 HIF-1α和HIF-2α調(diào)控表達的差異性

越來越多的研究表明，HIF-1α和HIF-2α在細胞內(nèi)的調(diào)控差異是較大的，有關(guān)HIF中α亞基調(diào)控差異見圖2。在氧氣和α-酮戊二酸存在下，脯氨酰羥化酶(PHD)和HIF抑制因子1(FIH1)羥化并使HIF的α亞基失活。PHD和FIH1活性受到缺氧和某些細胞內(nèi)代謝物如活性氧ROS、富馬酸酯、琥珀酸酯和潛在的2-羥基戊二酸的抑制，從而導(dǎo)致HIF的表達或翻譯受到影響。而HIF-1α蛋白的表達是在間歇性缺氧的情況下誘導(dǎo)的，但同時間歇性缺氧又會抑制HIF-2α的表達，沉默調(diào)節(jié)蛋白會抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，但卻會激活HIF-2α的轉(zhuǎn)錄活性。這種調(diào)控和轉(zhuǎn)錄機制表明，HIF-1α和HIF-2α?xí)谀承┥矸磻?yīng)中起到相反的作用，它們之間的平衡會對機體的代謝等產(chǎn)生很大的影響。

圖2 HIF低氧誘導(dǎo)因子α亞基的調(diào)控[6]

例如在小鼠的HIF研究中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α調(diào)節(jié)糖酵解，而HIF-2α則調(diào)節(jié)脂蛋白的代謝，且從小鼠的研究中還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α對腫瘤的形成起到關(guān)鍵作用，而HIF-2α對腫瘤的生長和發(fā)展影響很小。除此之外，在人的生理疾病研究中發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子介導(dǎo)的信號通路會調(diào)控機體某些組織在氧氣低于生理需求的情況下，適應(yīng)這種低氧環(huán)境，并發(fā)現(xiàn)了HIF-1α和HIF-2α獨特且重疊的靶基因。研究中HIF-1α的表達決定了對低氧的急性適應(yīng)，HIF-2α和HIF-3α的表達則會在人類內(nèi)皮的慢性低氧期間開始。在同類型的研究中，HIF-1α的誘導(dǎo)在缺氧發(fā)生后就會達到峰值，但HIF-2α的激活則發(fā)生的更慢且更持久，它們之間雖具有獨特的功能和作用，但同時也會激活部分重疊基因。因此對HIF-1α和HIF-2α是否擁有特定屬性展開了研究，發(fā)現(xiàn)了HIF-1α和HIF-2α轉(zhuǎn)錄因子的固有DNA結(jié)合特異性，這就可為同工型的HIF進行獨立靶向的轉(zhuǎn)錄表達，這些研究都為魚類低氧條件下HIF的調(diào)控機制提供了參考。

魚類研究中HIF-1α和HIF-2α調(diào)控表達也具有部分重疊的作用。例如在低氧條件下對斑馬魚的研究表明，HIF-1α和HIF-2α都會對造血內(nèi)皮的指示方面產(chǎn)生積極的影響，除此之外，在低氧條件下HIF-1α和HIF-2α同時存在也會促進動物造血干細胞的增加，但從斑馬魚的研究中來看，對HIF-1α和HIF-2α功能雙缺失的情況下幾乎不產(chǎn)生影響。但這只是斑馬魚研究中HIF與其中一種細胞的調(diào)控關(guān)系，在其它細胞的調(diào)控中它們也會出現(xiàn)抑制的情況。這就說明魚類中HIF-1α和HIF-2α在機體內(nèi)的調(diào)控機制既存在重疊也存在差異。

3 魚類中HIF的轉(zhuǎn)錄及蛋白特征

在魚類缺氧研究中，低氧確實會促進基因轉(zhuǎn)錄的升高，且反復(fù)缺氧或長時間缺氧都會導(dǎo)致HIF mRNA的升高，但在硬骨魚的研究中，初期的缺氧并未檢測到HIF mRNA的升高，因此對于硬骨魚在低氧條件下HIF信號是否被激活還需進一步研究。除了轉(zhuǎn)錄層面的研究，魚類中HIF蛋白的作用也不僅限于和低氧有關(guān)，在部分魚類的早期發(fā)育過程中，HIF蛋白就充當了很重要的角色，例如鮭魚在卵黃囊時期，HIF-1α的減少會對魚苗的死亡率產(chǎn)生影響；在斑馬魚和團頭魴中，HIF-1α和HIF-2α在魚卵中的mRNA也被發(fā)現(xiàn)，同時在斑馬魚的發(fā)育過程中，HIF-1α在其多個組織中都發(fā)生表達，而HIF本就參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮生長因子等基因的表達，因此這些發(fā)現(xiàn)都指向了HIF可能會參與到魚類的發(fā)育過程中。

4 HIF在魚類組織中的表達分布

低氧誘導(dǎo)因子HIF 在進化中很保守，使得HIF在無脊椎動物到哺乳動物中的表達和調(diào)控很相似，并在動物的大多數(shù)器官細胞中均表達。而水生動物相比于陸生動物，對水體中溶氧含量的適應(yīng)性差異較大，例如中華鱘和團頭魴都是對低氧十分敏感的物種，在常氧條件下，檢測到中華鱘-2的mRNA非常低，但卻高于同等條件下團頭魴的-1濃度。HIF的表達是外部環(huán)境因素和內(nèi)部相關(guān)基因等共同作用的結(jié)果，對-1克隆和鑒定的魚有青海湖裸鯉()、俄羅斯鱘()、舌齒鱸()、細須石首魚()等；對-1和-2都克隆和鑒定的有細須石首魚()、虹鱒()、斑馬魚()、草魚()等，其中在草魚和斑馬魚中還發(fā)現(xiàn)了-3α，這三種HIF在魚類組織中表達廣泛，在肝臟、鰓、腦、心臟、性腺、眼睛、肌肉等組織器官中均有表達，但這三種不同的HIF在每種魚的同一組織中表達水平存在差異。在斑馬魚的胚胎發(fā)育模式研究中，HIF-1α在胚胎發(fā)育的后期表達很明顯，而HIF-2α則會被限制在脊索、體節(jié)和血管等組織中，并且HIF-1α和HIF-2α在某些部位表達出現(xiàn)了重疊，有些部位則出現(xiàn)了互相抑制的現(xiàn)象，在脊索等組織中，當HIF-2α開始表達的時候，HIF-1α就開始停止表達了，這可能就和HIF參與了魚類生長發(fā)育有很大的關(guān)聯(lián)。

低氧環(huán)境的時間長短是否會對魚類產(chǎn)生不同的影響，有研究者則同時在急性低氧和長期低氧這兩種條件下來研究HIF-1α和HIF-2α的表達。細須石首魚在這兩種情況下，HIF-1α和HIF-2α的表達都明顯增高，且在腦和性腺中的表達量高于心臟、肝臟和肌肉組織，而虹鱒魚在急性低氧條件下HIF-1α的表達水平維持了恒定，這種結(jié)果表明，HIF的調(diào)控和表達可能還與魚的種類有密切的關(guān)系。

5 HIF在魚類生理反應(yīng)中的作用

魚類研究表明，HIF通路會影響相關(guān)靶基因的表達、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以及細胞的形成等生命活動。斑馬魚作為模式動物，是科學(xué)研究中主要的研究對象。現(xiàn)如今已對斑馬魚HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α與低氧耐受的能力進行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)HIF-1α和HIF-2α都可以對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生積極的影響，從而正向調(diào)節(jié)造血干細胞的形成，來應(yīng)對低氧環(huán)境；同時發(fā)現(xiàn)HIF-3α的缺失也降低了斑馬魚對低氧環(huán)境的耐受性，并通過紅系特異核蛋白轉(zhuǎn)錄因子(GATA1)調(diào)節(jié)紅細胞的數(shù)量來調(diào)控低氧耐受性。HIF-1α相比于HIF-2α和HIF-3α在斑馬魚中研究更廣，除了驗證HIF-1α與耐低氧的關(guān)系，還發(fā)現(xiàn)了HIF-1α對威爾遜氏病的影響，HIF-1α信號通路的調(diào)節(jié)可改善斑馬魚脂肪肝的變形，同時也可以降低威爾遜氏病中銅毒性的積累。斑馬魚中HIF通路的調(diào)控與低氧條件以及體內(nèi)多種細胞、相關(guān)基因和疾病都有關(guān)聯(lián)性的影響。

在研究低氧條件與HIF通路的關(guān)系同時，一些研究者也開始研究如何使魚耐受低氧，比如在羅非魚的研究中，通過投喂枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌可以提升羅非魚血液中血細胞的比容，使紅細胞、血紅蛋白和白細胞增加，并刺激魚肝中熱休克蛋白和低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的表達增加，提升羅非魚的耐低氧性。黃芩提取物對褐藍子魚HIF-1α的表達上調(diào)并同時具有消炎的功效。乳酸乳球菌對鯉HIF誘導(dǎo)的基因激活性更強。這些研究也為我們在提高魚類耐低氧方面提供了新的思路。

6 結(jié)語

目前對魚類耐低氧的研究已經(jīng)越來越廣泛，有關(guān)魚類對低氧環(huán)境的適應(yīng)策略、低氧信號相關(guān)基因的表達以及對低氧環(huán)境的適應(yīng)機制的研究都有了一定的進展，例如通過雌核發(fā)育的方法來研究雌性鈍嘴鯛比雄性鈍嘴鯛耐低氧更強的原因；或魚病防治研究中發(fā)現(xiàn)，鱖魚HIF-1不僅提高了耐低氧性同時也對該魚防病毒感染起到很好的作用。但其中具體的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及和某些疾病的引導(dǎo)關(guān)系還在逐一研究。雖然HIF相關(guān)亞型的克隆和鑒定也在各種魚類中展開，例如草魚HIF-4α的克隆和鑒定表明它同樣與低氧有關(guān)，但它的作用還不是研究得很清楚，因為其它魚中很少有這個亞型。

在魚類研究中，大量實驗表明HIF與低氧有關(guān)，但魚類中低氧誘導(dǎo)因子在低氧條件下發(fā)揮作用的分子機制還尚未完全清楚。因此HIF準確的分子機制是我們繼續(xù)研究的重點，這也可為今后魚類大規(guī)模養(yǎng)殖以及分子育種提供寶貴的經(jīng)驗。